Use este identificador para citar ou linkar para este item: http://repositorio.ufes.br/handle/10/10388
Título: Avaliação fenotípica de células musculares lisas vasculares de aorta de ratos estimuladas por lipopolissacarídeo
Autor(es): Strela, Felipe Bichi
Orientador: Vassallo, Paula Frizera
Data do documento: 10-Set-2018
Editor: Universidade Federal do Espírito Santo
Resumo: A sepse é definida como uma disfunção orgânica potencialmente fatal, causada por uma resposta desregulada do hospedeiro frente a uma infecção. Apresenta incidência e número de sobreviventes crescentes nas últimas duas décadas, sendo que estes sobreviventes apresentam risco elevado de desenvolver complicações, como eventos cardiovasculares, e mortalidade aumentada nos anos subsequentes a sepse. O lipopolissacarídeo (LPS) ativa os receptores do tipo toll 4 (TLR4), contribuindo para a resposta inflamatória na sepse. O TLR4 é também expresso em células musculares lisas vasculares (CMLVs), podendo modular o perfil fenotípico destas, e, cooperar para a fisiopatologia da sepse e alterações cardiovasculares no pós sepse. Objetivo: Avaliar os efeitos da estimulação com LPS sobre diferentes fenótipos de CMLVs, em cultura. Métodos: CMLVs primárias de aorta de ratos Wistar foram incubadas com LPS (1μg/mL) em diferentes protocolos experimentais. Duas condições de incubação foram usadas nos ensaios de contração e migração celulares: (1) estimulação aguda: estímulo iniciado nos ensaios; (2) Pré-condicionamento: estimulação por 24 ou 48 horas e retirada do estímulo nos ensaios. A Migração e contração celulares foram avaliadas utilizando os métodos de wound-healing e contração em gel de colágeno, respectivamente. Foram avaliadas também, a produção de óxido nítrico pela reação de Griess, a expressão gênica de citocinas, vimentina, colágeno e SM-22α, por RT-PCR, e a produção de IL-6 por ELISA. Resultados: A incubação com LPS por 6 horas aumentou a expressão de citocinas (IL-1β: 794%, IL-6: 2310%, TNFα: 380%, MCP-1: 99%), e por 24 horas aumentou a expressão gênica de marcadores de fenótipo secretório (colágeno: 27%, vimentina: 29%), e SM22α (53%), molécula relacionada com migração e contração celular. O LPS aumentou a secreção de IL-6 após 24 horas (487%) e 48 horas (418%), e de NO após 8 horas (8%) e 24 horas (52%), aumentos estes na produção de NO revertidos pela aminoguanidina (inibidor da iNOS). A estimulação aguda com LPS reduziu a migração (-20%) e a contração (-38%), achados revertidos pela aminoguanidina. O pré-condicionamento com LPS aumentou a migração (16%) e a contração (154%) das CMLVs, achados estes revertidos com tocilizumabe (inibidor do receptor de IL-6). Conclusão: O LPS exerce efeitos modulando os fenótipos secretório, contrátil e migratório. A estimulação aguda com LPS promoveu redução, dependente do óxido nítrico, da resposta migratória e contrátil, sugerindo que as respostas agudas das CMLVs ao LPS podem contribuir para a fisiopatologia da sepse. Já o pré-condicionamento com LPS, promoveu aumentos, dependentes da IL-6, na migração e contração das CMLVs, com possível participação da SM22α, o que evidência que estas células mesmo após interrupção do estímulo apresentam modificações de fenótipo que podem contribuir para ocorrência de eventos cardiovasculares.
Introduction: Sepsis is defined as a potentially fatal organic dysfunction caused by a dysregulated host response to infection. It presents an increasing incidence and number of survivors in the last two decades, and these survivors are at high risk of developing complications, such as cardiovascular events, and increased mortality in the years following sepsis. Lipopolysaccharide (LPS) activates Toll-like receptor 4 (TLR4), contributing to the inflammatory response in sepsis. TLR4 is also expressed in vascular smooth muscle cells (VSMCs), and can modulate the phenotypic profile of these, and, cooperate for the pathophysiology of sepsis and cardiovascular changes in post sepsis. Objective: To evaluate the effects of LPS stimulation on different CMLV phenotypes, in culture. Methods: Primary aortic VSMCs from Wistar rats were incubated with LPS (1μg/mL) in different experimental protocols. Two incubation conditions were used in cell contraction and migration assays: (1) acute stimulation: stimulus initiated in the assays; (2) Preconditioning: stimulation for 24 or 48 hours and withdrawal of the stimulus in the assays. Cell migration and contraction were evaluated using the wound-healing and collagen gel contraction methods, respectively. Nitric oxide production by the Griess reaction, cytokine, vimentin, collagen and SM-22α genic expression by RT-PCR, and IL-6 production by ELISA were also evaluated. Results: Incubation with LPS for 6 hours increased the expression of cytokines (IL-1β: 794%, IL-6: 2310%, TNFα: 380%, MCP-1: 99%), and for 24 hours increased the gene expression of secretory phenotype markers (collagen: 27%, vimentin: 29%) and SM22α (53%), a molecule related to migration and cell contraction. LPS increased IL-6 secretion after 24 hours (487%) and 48 hours (418%), and NO secretion after 8 hours (8%) and 24 hours (52%), these increases in NO production reversed by aminoguanidine (iNOS inhibitor). Acute stimulation with LPS reduced migration (-20%) and contraction (-38%), reversed by aminoguanidine. Pre-conditioning with LPS increased the migration (16%) and the contraction (154%) of the VSMCs, which were reversed with tocilizumab (IL-6 receptor inhibitor). Conclusion: LPS exerts effects modulating the secretory, contractile and migratory phenotypes. Acute stimulation with LPS promoted nitric oxide-dependent reduction of migratory and contractile response, suggesting that the acute responses of VSMCs to LPS may contribute to the pathophysiology of sepsis. 12 On the other hand, pre-conditioning with LPS promoted IL-6-dependent increases in the migration and contraction of VSMCs, with a possible participation of SM22α, evidencing that these cells even after discontinuation of the stimulus present phenotype modifications that may contribute to the occurrence of cardiovascular events
URI: http://repositorio.ufes.br/handle/10/10388
Aparece nas coleções:PPGCF - Dissertações de Mestrado

Arquivos associados a este item:
Arquivo TamanhoFormato 
tese_12582_Dissertação Felipe Bichi Strela.pdf1.99 MBAdobe PDFVisualizar/Abrir


Os itens no repositório estão protegidos por copyright, com todos os direitos reservados, salvo quando é indicado o contrário.