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Título: Avaliação dos efeitos do tratamento com Sildenafil sobre células de medula óssea de camundongos hipercolesterolêmicos
Autor(es): Bernardes, Franciane Pereira
Orientador: Meyrelles, Silvana dos Santos
Data do documento: 30-Dez-2015
Editor: Universidade Federal do Espírito Santo
Resumo: A hipercolesterolemia, além de ser um dos principais fatores que levam ao desenvolvimento da aterosclerose, provoca danos oxidativos e genotóxicos em células de medula óssea. O Sildenafil tem sido utilizado com sucesso em pesquisas cardiovasculares e, no caso da aterosclerose, demonstra efeitos positivos na diminuição do estresse oxidativo e de marcadores de danos genotóxicos em modelos experimentais de aterosclerose (camundongo knockout para a apolipoproteina E - apoE-/-). Neste trabalho foi testada a hipótese de que o tratamento com Sildenafil seria capaz de melhorar possíveis danos que a hipercolesterolemia comprovadamente causa nas células de medula óssea de camundongos apoE-/-. Foram utilizados camundongos machos com 03 meses de idade divididos em três grupos: controle C57BL/6 (C57), veículo (apoE-/- V) e tratado (apoE-/- S) os quais foram submetidos ao tratamento com Sildenafil 40mg/Kg/Dia ou Veículo por três semanas. Durante o período de tratamento foram feitas coletas de sangue periférico e no último dia de tratamento as células de medula óssea dos fêmures e tíbias foram isoladas e submetidas a protocolos de citometria de fluxo, dosagem de colesterol plasmático e teste do micronúcleo. O estresse oxidativo foi avaliado por meio da determinação dos níveis das Espécies Reativas de Oxigênio (EROs) ânion superóxido (O2-) e peróxido de hidrogênio (H2O2) nos ensaios de citometria de fluxo DHE e DCF, respectivamente. Foram adquiridas informações acerca das fases do ciclo celular das células de medula óssea por meio de marcação com Iodeto de Propídeo (PI) e a estimativa de danos genotóxicos e citotóxicos foi feita por meio do teste do micronúcleo de medula óssea e de sangue. Os dados obtidos foram submetidos à Análise de Variância (ANOVA) de uma via seguida do post hoc de Fisher ou, quando cabível, ao teste t de student para amostras independentes e os resultados estão expressos como média ± EPM e considerados estatisticamente significativos quando *p < 0,05. Os dados relativos às EROs indicam que animais apoE-/- V apresentam maiores níveis de ânion superóxido quando comparados ao grupo controle (C57) e ao grupo que recebeu Sildenafil (apoE-/- V: 2217,6±361,0* versus C57: 1128,2±28,0 versus apoE-/- S: 1125,7±190,8#). Os níveis de H2O2 também se apresentaram aumentados no grupo apoE-/- V, com valores de 2847,0±191,0* versus C57: 2181,0±107,7 versus apoE-/- S: 2107,0±80,60#. Quanto às características do ciclo celular, os valores obtidos apontaram para uma maior fragmentação de DNA nos animais do grupo veículo com relação ao controle e ao tratado (apoE-/- V: 2,14±0,12* versus C57: 1,59±0,10 versus apoE-/- S 1,31±0,11#). Também constatou-se no grupo veículo uma maior proporção de células de medula óssea no momento G0/G1 (apoE-/- V: 75,45±0,70* versus C57: 68,60±0,53 versus apoE-/- S: 67,75±1,60#). Além disso, os dados de micronúcleo sugerem que os animais hipercolesterolêmicos que não receberam tratamento com Sildenafil apresentam danos genotóxicos expressivos na medula (apoE-/- V: 6,4±0,35* versus C57: 3,5±0,27 versus apoE-/- S: 5,0±0,41#) e no sangue (apoE-/- V: 7,6±0,80* versus C57: 4,0±0,37 versus apoE-/- S: 3,95±0,40#) em comparação ao grupo tratado com Sildenafil. Em conjunto, os resultados indicam que o tratamento com Sildenafil em camundongos hipercolesterolêmicos foi capaz de produzir efeitos benéficos no ambiente medular demonstrados pela menor produção de EROs, menor quantidade de DNA fragmentado e menor quantidade de células micronucleadas na medula óssea e no sangue periférico.
Hypercholesterolemia, besides being a major factor leading to the development of atherosclerosis, causes oxidative and genotoxic damage in bone marrow cells. Sildenafil has been used successfully in cardiovascular research and in the case of atherosclerosis, shows positive effects in the reduction of oxidative stress and the genotoxic damage markers of atherosclerosis in experimental models (Knockout mouse apolipoprotein E - apoE-/- ). In this study we tested the hypothesis that treatment with sildenafil would be able to improve the damage caused by the hypercholesterolemia on the bone marrow cells from apoE-/- mice. Male mice were used at 03 months of age divided into three groups: C57BL/ 6 control (C57), vehicle (apoE-/- V) and treated (apoE-/- S) which were subjected to treatment with Sildenafil 40 mg/kg/Day or vehicle for three weeks. During the treatment period, peripheral blood samples were taken and on the last day of treatment the bone marrow cells from the femurs and tibias were isolated and subjected to flow cytometry protocols, dosage and serum cholesterol micronucleus test. Oxidative stress was evaluated by determining the levels of Reactive Oxygen Species (ROS) superoxide anion (O2 - ) and hydrogen peroxide (H2O2) on cytometry flow assays DHE and DCF, respectively. Information has been obtained on the cell cycle phases of bone marrow cells by staining with propidium iodide (PI) and the estimation of genotoxic and cytotoxic damage was done through the micronucleus test of bone marrow and blood. Statistical analysis was performed using the one-way analysis of variance (ANOVA). When the ANOVA showed significant differences, the Fisher’s test was performed as a post hoc analysis. When appropriate, the Student t test for independent samples was performed. The results are expressed as mean ± SEM and the differences between means were considered statistically significant p < 0.05. Data on ROS indicate that apoE-/- V animals had higher levels of superoxide anion compared with the control group (C57) and the group receiving Sildenafil (apoE-/- V: 2217.6±361.0* versus C57: 1128.2±28.0 versus apoE-/- S: 1125.7±190.8 # ). Hydrogen peroxide levels also had increased in the group apoE-/- V with values about 2847.0±191.0* versus C57: 2181.0±107.7 versus apoE-/- S: 2107.0±80.60# . Regarding the characteristics of the cell cycle, the values obtained indicate a greater DNA fragmentation in the animals of vehicle group compared to the control and treated (apoE-/- V: 2.14±0.12* versus C57: 1.59±0.10 versus apoE-/- S 1.31±0.11# ). It was also observed in the vehicle group had a greater proportion of bone marrow cells when G0/G1 (apoE-/- V: 75.45±0.70* versus C57: 68.60±0.53 versus apoE-/- S: 67.75±1.60# ). Furthermore, the micronucleus data suggest that hypercholesterolemic animals receiving vehicle have significant genotoxic damage in the bone marrow (apoE-/- V: 6.4±0.35* versus C57: 3.5±0.27 versus apoE-/- S: 5.0±0.41# ) and blood (apoE-/- V: 7.6±0.80* versus C57: 4.0±0.37 versus apoE-/- S: 3.95±0.40# ) compared to the group treated with Sildenafil. Together, these results indicate that treatment with sildenafil in hypercholesterolemic mice was able to produce beneficial effects on the bone marrow environment demonstrated by a lower production of ROS, smaller amount of fragmented DNA and least amount of micronucleated cells in the bone marrow and peripheral blood.
URI: http://repositorio.ufes.br/handle/10/8016
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