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Título: Caracterização bioquímica e farmacológica da Sp-CTx- Toxina Multifuncional da Peçonha do Peixe Escorpião Scorpaena Plumieri
Autor(es): Malacarne, Pedro Felipe
Orientador: Pires, Rita Gomes Wanderley
Coorientador: Figueiredo, Suely Gomes de
Data do documento: 30-Mar-2017
Editor: Universidade Federal do Espírito Santo
Resumo: Citolisinas são produzidas por diversos organismos e apresentam atividade tóxica a células individuais, causando dissolução através de lise. Citolisinas de peçonhas de peixes são proteínas multifuncionais que apresentam efeitos neurotóxicos, cardiotóxicos e inflamatórios, sendo descritas como “fatores proteicos letais”. Uma citolisina hemolítica lábil, formadora de poro, denominada Sp-CTx – Scorpaena plumieri - Cytolytic Toxin (glicoproteína, 2 subunidades de 65 kDa), foi recentemente purificada da peçonha do peixe escorpião Scorpaena plumieri. O objetivo deste trabalho foi estabelecer condições ótimas de manutenção da atividade hemolítica de Sp-CTx e dar continuidade à sua caracterização bioquímica e farmacológica. A estabilidade da Sp-CTx em diferentes condições (pH, temperatura e presença de cosolutos) e o efeito de diferentes cátions e lipídios de membrana sobre a atividade hemolítica foram avaliadas em eritrócitos de coelho. Foi demonstrado que a atividade hemolítica da Sp-CTx é mantida quando armazenada em 500 mM de NaCl, 1 M de sulfato de amônio, 60 mM de trealose e 10% de glicerol em pH 7,4 a 4 ºC e em glicerol 10% a -80 e -196 ºC. Também foi visto que a atividade hemolítica da Sp-CTx é dependente de cálcio e é completamente inibida por EDTA. O colesterol e o fosfatidilglicerol reduziram a hemólise induzida pela toxina, o que sugere que a toxina forma poro do tipo barril e é dependente da interação eletrostática com lipídios de membrana. Os motivos de carboidratos da Sp-CTx foram avaliados por western blot usando o kit “DIG Glycan Differentiation” sugerindo a presença dos motivos: galactose (1-4) N-acetilglucosamina e ácido siálico (2-3) galactose em complexos de N- e/ou O-glicanos. A resposta inflamatória induzida pela Sp-CTx foi avaliada usando como modelo o teste da pata de camundongo. Sp-CTx induziu nocicepção e resposta edematogênica local dose-dependente. O edema induzido foi significativamente reduzido pela administração prévia de HOE-140 e de aprotinina. Estes dados evidenciam o envolvimento do sistema calicreína-cinina na resposta inflamatória induzida por Sp-CTx.
Cytolysins are substances elaborated by many different organisms that exhibit toxic activities on cells, causing its dissolution through cytolysis. Fish venom cytolysins are multifunctional proteins that display neurotoxic, cardiotoxic and inflammatory effects, described as "protein lethal factors". A pore-forming labile hemolytic cytolysin called Sp-CTx (Scorpaena plumieri - Cytolytic Toxin) (glycoprotein, 2 subunits of 65 kDa) was recently purified from the venom of the scorpionfish Scorpaena plumieri. The aim of this work was to establish optimal storage conditions to maintain the activities of this toxin and to continue its biochemical and pharmacological characterization. For this, SpV (Scorpaena plumieri Venom) and Sp-CTx were stored in different conditions (pH, temperature and in the presence of co-solutes), for different periods of time. Afterwards, their hemolytic activity on rabbit erythrocytes was compared to the activity of the freshly extracted venom and purified toxin. We also evaluated the effects of different cations and membrane lipids on the hemolytic activity of Sp-CTx. It was demonstrated that storage of Sp-CTx at -4 ºC in pH 7,4 with 500mM NaCl, 1M (NH4)2SO4, 60mM of threalose and 10% glycerol, and at -80 and -196 ºC with glycerol 10% were effective in maintaining the hemolytic activity. Furthermore, the hemolytic activity is calcium dependent and completely inhibited by EDTA. Cholesterol and phosphatidylglycerol reduced the hemolytic activity of Sp-CTx which suggests that it is a barrel-pore-forming toxin and that the pore formation is dependent of electrostatic interactions with membrane lipids. Through western blot, using the “DIG Glycan Differentiation” kit, sugar motifs of Sp-CTx were evaluated, which suggested the presence of: galactose (1-4) N-acetylglucosamine and sialic-acid (2-3) galactose in N- and/or O- glycan complexes. Using the mouse hindpaw test it was shown that Sp-CTx induced intensive nociception and dose-dependent edematogenic responses in the mice footpad Sp-CTx. The local induced edema was considerably reduced by previous administration of aprotinin and HOE-140. These data suggest the involvement of the kinin– kallikrein system in the inflammatory response induced by Sp-CTx.
URI: http://repositorio.ufes.br/handle/10/7867
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