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Título: Análise transcriptômica da interação de abacaxizeiro com o Pineapple mealybug wilt-associated virus
Autor(es): Peron, Fernanda Nunes
Orientador: Fernandes, Patricia Machado Bueno
Coorientador: Ventura, José Aires
Data do documento: 29-Jun-2018
Editor: Universidade Federal do Espírito Santo
Resumo: Ananas comosus var comosus é uma fruteira de grande valor econômico e nutricional. A produtividade da cultura do abacaxi é influenciada pela virose murcha do abacaxizeiro (MWP, do inglês mealybug wilt pineapple). Essa doença é causada pelo Pineapple mealybug wilt-associated virus (PMWaV) sendo as variantes PMWaV-1 e PMWaV-2 associadas aos sintomas da doença. Os sintomas decorrem da morte das raízes seguido de murcha e descoloração das folhas com avermelhamento e consequente alteração na floração e frutificação. O controle da disseminação da doença pela remoção das plantas sintomáticas não é satisfatório especialmente porque plantas assintomáticas infectadas servem de fonte de inóculo do vírus através de mudas infectadas. O transcriptoma diferencial entre plantas infectadas sintomáticas e assintomáticas foi avaliado por RNA-seq, ferramentas de bioinfomática e RT-qPCR para propor uma compreensão da patogênese do PMWaV em condições de campo. Adicionalmente proteínas foram confirmadas por análise de espectrometria de massa. Com base no genoma de referência de Ananas comosus, foram identificados 16.097 genes expressos sendo 268 reprimidos e 122 induzidos. A performace do RNA-seq foi confirmada para 14 genes direrencialmente expressos (DEGs) com uma correlação de Pearson satisfatória (R = 0,79). Análises de classificação funcional e enriquecimento revelaram indução de genes envolvidos na regulação da floração enquanto que os genes reprimidos foram predominantemente relacionados aos mecanismos de defesa a estresse abiótico e biótico. Entre eles, alguns fatores de transcrição (FT) WRKYs e MYBs; PRs; HSPs; AQPs e genes que codificam enzimas removedoras de ROS e transportadores de Cobre, Cálcio e Zinco foram reprimidos. Por outro lado, a expressão de genes responsivos a auxina foram positivamente regulados por ARFs. Observamos regulação hormonal mediada pela inibição da biossíntese de jasmonato (JA), indução da biossíntese de etileno (ET) e indução da expressão de genes responsivos a auxina e que foi relacionada ao desenvolvimento de sintomas. Uma rede de interação proteina-proteina foi predita permitindo a visualização da interação dos produtos gênicos dos DEGs com agrupamento de chaperonas. A inibição da expressão dos genes que codificam as chaperonas ERDJ3B, BiP2 e RTM2 foi confirmada em plantas sintomáticas. Além disso, uma significativa correlação negativa (R = -0,715) entre os níveis de transcritos de RTM2 e PMWaV-2 foi identificada. Como a expressão desse vírus é predominante nas plantas sintomáticas, propomos RTM2 como um provável gene associado ao controle do deslocamento de PMWaV-2 via floema. Além disso, uma proteína HSP20 foi identificada somente nas amostras de plantas assintomáticas reforçando a hipótese do envolvimento de uma HSP20 no controle da infecção. Foram também identificadas as proteínas HSP70, CaM e CRT. Estas proteínas tiveram a expressão gênica reprimida nas plantas sintomáticas apontando para o estresse no retículo endoplasmático (RE) como reposta a infecção pelo PMWaV. Como os vírus necessitam da maquinaria celular, admiti-se que as plantas de abacaxi reprimam a expressão de chaperonas residentes no RE na via UPR (do inglês, unfolfed protein response) como estratégia para limitar o patógeno no sítio de infecção. Contudo, com a inbição da via SAR (do inglês, systemic acquired resistance) e da expressão de RTM2, possíveis barreiras ao deslocamento de PMWaV-2 foram suprimidas. Além disso, a expressão de IRE1 revela a ativação da UPR para a morte celular por apoptose. Assim, surpreendentemente conclui-se que a infecção por PMWaV-2 desencadeia a resposta hipersensitiva através da UPR além de modular a expressão de genes R. Diante do exposto, esta tese contribui para a revisão dos métodos adotados para o manejo de MWP tanto a nível dos tratos culturais como a nível de melhoramento genético do abacaxi.
Ananas comosus var comosus is a fruit of great economic and nutritional value worldwide. The productivity of the pineapple crop is influenced by mealybug wilt of pineapple (MWP). This disease is caused by Pineapple mealybug wilt-associated virus (PMWaV), the PMWaV-1 and PMWaV-2 variants are associated with the symptoms of the disease. The symptoms derive from the atrophy of the roots followed by wilting and discoloration of the leaves with redness and consequent deficiency in fruiting. The control of the disease occurs by the removal of symptomatic plants is not satisfactory especially since infected asymptomatic plants serve as a source of virus dispersion through their seedlings. Therefore, in this work, the differential transcriptome between symptomatic and asymptomatic infected plants was evaluated by RNA-seq, bioinformatic tools and RT-qPCR to propose an understanding of the pathogenesis of MWP under field conditions. Additionally, the proteins were confirmed by mass spectrometry analysis. Based on the reference genome of Ananas comosus, 16,097 expressed genes were identified, 268 repressed and 122 induced. The performance of RNA-seq was confirmed for 14 expressively expressed genes (DEGs) with a satisfactory Pearson correlation (R = 0.788). Functional classification and enrichment analysis revealed induction of genes involved in the regulation of flowering while repressed genes were predominantly related to the defense mechanisms of abiotic and biotic stress. Among them, some transcription factors (FT) WRKYs and MYBs, PRs, HSPs, AQPs and genes encoding ROS-removing enzymes, and Copper, Calcium and Zinc transporters were repressed. On the other hand, the expression of auxin responsive genes was positively regulated by ARFs. We observed hormonal regulation mediated by inhibition of jasmonate biosynthesis (JA), induction of ethylene biosynthesis (ET) and induction of the expression of genes responsive to auxin, what was related to the development of symptoms. A protein-protein interaction network was predicted allowing the visualization of the interaction of the gene products of the DEGs. Therefore, it was possible to observe the grouping of chaperones in the center of the network. We confirmed the inhibition of expression of the genes encoding the ERDJ3B, BiP2 and RTM2 chaperones in symptomatic plants and identified a significant negative correlation (R = -0.715) between the levels of RTM2 and PMWaV-2 transcripts. As the expression of this virus is predominant in symptomatic plants, we propose RTM2 as a probable gene associated with PMWaV-2 dispersion control. In addition, an HSP20 protein was identified only in asymptomatic plant samples reinforcing the hypothesis of HSP20 involvement in infection control. In the same way, we identified the HSP70, CaM and CRT proteins. These proteins had the repressed gene expression in the symptomatic plants pointing to stress in the endoplasmic reticulum (ER) as a response to PMWaV infection. Because viruses require the cellular machinery, we believe that pineapple plants suppress the expression of resident chaperones in the UPR (unfolfed protein response) as a strategy to limit the pathogen at the site of infection. However, with the introduction of SAR (systemic acquired resistance) and RTM2 expression, possible barriers to the displacement of PMWaV-2 were suppressed. In addition, the IRE1 expression reveals the activation of UPR to cell death by apoptosis. Thus, it is surprisingly concluded that PMWaV-2 infection elicits a hypersensitive response through UPR, in addition to modulating R gene expression.In view of the above, this thesis contributes to the revision of the methods adopted for the management of MWP both in cultural practices and the level of genetic improvement of pineapple.
URI: http://repositorio.ufes.br/handle/10/10524
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