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Título: Otimização do processo de descelularização renal para obtenção de arcabouço acelular
Autor(es): Destefani, Afrânio Côgo
Orientador: Nogueira, Breno Valentim
Data do documento: 31-Out-2018
Editor: Universidade Federal do Espírito Santo
Resumo: A Doença Renal Crônica (DRC) é caracterizada pela deterioração progressiva da função renal, que pode comprometer diferentes tecidos e órgãos. O principal tratamento indicado para pacientes com DRC é o transplante renal. No entanto, a falta de órgãos disponíveis, bem como a alta taxa de rejeição de órgãos, sustenta a necessidade de novas terapias. Assim, a implementação da bioengenharia tecidual para a regeneração de órgãos surgiu como uma alternativa ao transplante tradicional de órgãos. Atualmente, demasiado tempo tem sido expendido na descelularização renal total por perfusão com detergentes. Nestes casos há perda de componentes essenciais da matriz extracelular (MEC) e desarranjos na arquitetura do arcabouço obtido o quê substancialmente pode influenciar no repovoamento celular subsequente. Neste trabalho a descelularização total de rins de ratos foi obtida em um tempo reduzido (6 horas) com a utilização de solução de detergente iônico (SDS, 1%) através da artéria renalsob pressão (100 mmHg) e fluxo (1,0 mL/min) controlados. Ao final desta etapa, os arcabouços renais apresentavam características físicas translúcidas e condutos vasculares preservados. A análise histoquímica e a microscopia eletrônica revelaram glomérulos com a membrana basal preservada, além de rede tubular e vascular sem resíduo de restos celulares e DNA. A análise proteômica identificou a preservação de proteínas majoritárias relacionadas aos compostos da MEC. Assim, o uso de baixa concentração de SDS por 6 horas promoveu uma descelularização bem-sucedida, além de preservar a MEC com mínimo resíduo de SDS (<0,01%). Além disso desenvolvemos um índice de retração como cálculo de correção devido a retração elástica do rim após o processamento. A microscopia eletrônica, a quantificação espectrofotométrica e as análises de espectrometria de massas foram realizadas para comparar os resultados. Demonstramos que a análise histológica, técnica fácil e de baixo custo, apresentou excelentes resultados quando o índice de retração foi aplicado, permitindo a comparação das amostras antes e após o processo com dados confiáveis. De posse desses dados demonstramos que é possível a redução no tempo de descelularização com a preservação de componentes importantes da MEC.
Chronic Kidney Disease (CKD) is characterized by progressive deterioration of renal function, which can compromise various tissues and organs. The main therapy indicated for patients with CKD is renal transplantation. However, the absence of available organs, as well as an organ rejection rate, is required for new therapies. Thus, the implementation of bioengineering for organ regeneration has emerged as an alternative to traditional organ transplantation. Currently, overtime has been expended on total renal decellularization by perfusion with detergents. In these cases, there is a loss of essential components of the extracellular matrix (ECM) and derangements in the scaffold architecture obtained which can substantially influence subsequent cell repopulation. In this work, the total discoloration of rat kidneys was measured in reduced time with the use of detergent solution (SDS, 1%) by renal technique under pressure (100 mmHg) and flow (1.0 mL/min). At the end of this stage, the scaffolds were incorporated as translucent physical characteristics and preserved vascular conduits. An electron microscopic and histochemical analysis revealed glomeruli with a preserved basement membrane, as well as a tubular and vascular network with no cell and DNA residues. Proteomic analysis identified the preservation of majority proteins related to ECM compounds. Thus, the use of low concentration of SDS for 6 hours promoted a successful thawing, in addition to preserving a MEC with the minimum residue of SDS (<0,01%). Also, we developed a retraction index as a correction calculation due to elastic retraction of the kidney after processing. Electron microscopy, spectrophotometric quantification, and mass spectrometry analyzes were performed to compare the results. We demonstrated that the histological analysis, easy technique, and low cost, presented excellent results when the correction index was applied, allowing the comparison of samples before and after the process with reliable data. With these data, we demonstrate that it is possible to reduce the time of decellularization with the preservation of essential components of the ECM.
URI: http://repositorio.ufes.br/handle/10/10755
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