Universidade Federal do Espírito Santo Centro de Ciências da Saúde Programa de Pós-Graduação em Doenças Infecciosas Debora Maria Pires Gonçalves Barreira DIVERSIDADE GENÉTICA DE NOROVÍRUS EM INDIVÍDUOS COM DIARREIA AGUDA: UMA ANÁLISE TEMPORAL Vitória – ES 2019 Debora Maria Pires Gonçalves Barreira DIVERSIDADE GENÉTICA DE NOROVÍRUS EM INDIVÍDUOS COM DIARREIA AGUDA: UMA ANÁLISE TEMPORAL Vitória – ES 2019 Tese apresentada ao Programa Pós- Graduação em Doenças Infecciosas do Núcleo de Doenças Infecciosas da Universidade Federal do Espírito Santo como requisito parcial para obtenção do grau de Doutora em Doenças Infecciosas. Orientadora: Profª Drª Liliana Cruz Spano Aos meus queridos filhos, Laura e Vitor, quando olho para vocês posso perceber a magnitude do amor de Deus por mim. AGRADECIMENTOS • A Deus, pelo infinito amor e bondade, por me dar as forças que nem eu sabia que poderia ter, por me dar coragem para enfrentar desafios aparentemente intransponíveis; • À Liliana, minha orientadora, manifesto profunda gratidão pelo auxílio, confiança, ensinamentos e paciência. Admiro sua fé em Deus, sua capacidade intelectual e seu rigor científico; • Aos amigos do LabVir, Laís, Luciana, Marco André, Izabella, Taiz, Caroline, Núbia, pela generosidade e competência, parte desta conquista devo a vocês; • Ao Dr Túlio Machado Fumian, grande referência em norovírus no Brasil, pela disponibilidade, simplicidade e apoio em todos os momentos que precisei; • Aos meus pais maravilhosos, por tanto amor, por tantas orações, por meio das quais sou sustentada todos os dias (e noites de trabalho), por me ensinarem o valor do estudo, apesar de não terem tido a mesma oportunidade no passado. Também aos meus irmãos, Adriano e Gustavo, pelo amor e pela torcida; • Ao meu marido Thiago pelo amor, cumplicidade, encorajamento e presença incansável ao meu lado nos momentos mais difíceis; • À pediatra Alba Lilia, coordenadora da vigilância epidemiológica do Hospital Infantil Nossa Senhora da Glória, por ter nos recebido com tanta disposição e às crianças do pronto socorro, sem as quais não seria possível a execução deste trabalho. PREÂMBULO Este documento de tese está apresentado no formato de manuscritos, contendo, além de uma breve introdução, de revisão de literatura e discussão, os seguintes anexos e item: (i) uma publicação de artigo como primeira autora (Anexo 3) com a descrição de uma recombinante emergente de norovírus GII.P16-GII.4 Sydney 2012 pela primeira vez no Brasil; (ii) uma publicação de artigo como coautora (Anexo 4) com a descrição de um surto de gastroenterite causado pelo norovírus recombinante GII.Pe-GII.4 Sydney 2012, ocorrido em unidade intensiva neonatal e pediátrica de um hospital da região metropolitana de Vitória, no mesmo ano de sua primeira descrição no mundo; (iii) um manuscrito a ser submetido para publicação com a descrição de variantes/recombinantes de norovírus detectados em três períodos de coleta de espécimes em nossa área geográfica (2003-2004, 2007-2011 e 2017-2018) (Anexo 5); (iv) Dados Complementares (Item 4), nos quais estão descritos resultados obtidos e ainda não registrados em manuscritos. RESUMO Norovírus humanos, pertencentes a três genogrupos e mais de 30 genótipos, são a principal causa de gastroenterite esporádica e de surtos no mundo. Eles são caracterizados por uma significativa evolução devida a eventos de mutações e recombinação, e geração de variantes de disseminação pandêmica. O objetivo deste estudo foi determinar a diversidade genética de norovírus em indivíduos com gastroenterite em nossa área geográfica. Três grupos de amostras fazem parte deste estudo: (i) espécimes fecais obtidos prospectivamente de crianças com diarreia (n=307) coletadas entre outubro de 2014 e setembro de 2018; (ii) espécimes positivos para norovírus (n=78) obtidos de crianças e adultos nos períodos de fevereiro de 2003 a junho de 2004 e dezembro de 2007 a junho de 2011; e (iii) espécimes positivos para norovírus (n=2) associado a um surto de gastroenterite em unidade hospitalar em 2012. A detecção dos norovírus foi realizada RT-qPCR para região de junção ORF1-ORF-2. Os genótipos foram determinados pela análise filogenética de sequências parciais da polimerase e do capsídeo. Sequenciamento completo da proteína do capsídeo (VP1) GII.4 Sydney 2012 e quase completa da polimerase GII.P16 da nova recombinante GII.4 Sydney [P16] foram obtidos e realizada a análise filogenética. Norovírus foram detectados em 24.4% (75/307) dos espécimes do estudo prospectivo e a análise filogenética (n=52) demonstrou o predomínio da recombinante GII.P16- GII.4 Sydney 2012 (n=27), descrita pela primeira vez no Brasil, seguida dos genótipos GII.4 Sydney 2012[P31] (n= 10) e GII.17[P17] (n=5), além de sete outros recombinantes em menor número de casos (GII.2[P16], GII.6[P7], GII.3[P16], GII.4 Sydney 2012[PNA], GII.1[Pg], GII.4 Sydney 2012[P4 New Orleans] e GI.7[P7]). Houve substituições de aminoácidos nas proteínas: (i) polimerase GII.P16 de cepas que circularam em 2016 e 2017 em comparação com sequências pré-2015 (disponíveis no GenBank); e em (ii) VP1 de cepas GII.4 Sydney 2012 associadas com GII.P16 (2016 e 2018) em comparação com aquelas associadas com GII.P31 antes de 2015. Foram detectadas diferentes variantes GII.4 em todos os períodos de coleta de amostras, coincidindo com a circulação no mundo. A recombinante GII.4 Sydney 2012[P31] foi a responsável pelo surto no hospital, ocorrido no mesmo ano de sua primeira descrição no mundo. Nosso estudo mostra a grande diversidade genética de norovírus circulando em nossa área geográfica e destaca o relato inédito da recombinante emergente GII.4 Sydney 2012[P16] no Brasil. SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................................... 1 2 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................................. 2 2.1 Breve Histórico ................................................................................................................. 2 2.2 Estrutural viral ................................................................................................................... 3 2.3 Classificação ..................................................................................................................... 6 2.4 Evolução ............................................................................................................................ 8 2.5 Patogênese ..................................................................................................................... 12 2.6 Epidemiologia e aspectos clínicos da infecção ......................................................... 14 2.7 Vacina .............................................................................................................................. 15 3 OBJETIVOS ........................................................................................................................... 17 3.1 Objetivo Geral ................................................................................................................. 17 3.2 Objetivos Específicos ............................................................................................... 17 4 DADOS COMPLEMENTARES ........................................................................................... 18 4.1 Caracterização das amostras do estudo prospectivo .............................................. 18 Aspectos Éticos da Pesquisa ............................................................................................. 19 4.1.2 Distribuição de amostras de fezes e casos de norovírus de acordo com idade das crianças infectadas, local e mês de coleta. ............................................... 19 Figura 6. Distribuição dos casos positivos de NoV de acordo com os meses de coleta. ................................................................................................................................. 20 4.1.3 Principais manifestações clínicas ........................................................................ 21 4.1.4 Distribuição dos genótipos de norovírus por mês de coleta ............................ 21 4.1.5 Quantificação de RNA viral nas fezes ................................................................. 22 4.2 Análise molecular da polimerase quase completa e do capsídeo completo (VP1) ................................................................................................................................................. 23 4.2.1 Sequenciamento - Polimerase quase completa e VP1 .................................... 24 4.2.2 Análise Filogenética ............................................................................................... 25 4.2.3 Análise da variação de aminoácidos ................................................................... 28 4.2.3.1 Capsídeo (VP1 completa) .................................................................................. 28 4.2.3.2 Polimerase quase completa .............................................................................. 29 5 DISCUSSÃO .......................................................................................................................... 30 6 CONCLUSÕES ..................................................................................................................... 36 7 REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 37 ANEXO 1 ................................................................................................................................... 56 ANEXO 2 ................................................................................................................................... 57 ANEXO 3 ................................................................................................................................... 58 ANEXO 4 ................................................................................................................................... 59 ANEXO 5 ................................................................................................................................... 60 1 1 INTRODUÇÃO Os norovírus são reconhecidos como a principal causa de gastroenterite em indivíduos de todas as idades, responsáveis por aproximadamente 20% dos casos de diarreia e 212.000 casos de morte no mundo, acometendo de forma mais grave crianças, idosos e pacientes imunodeprimidos (Ahmed et al, 2014; Pires et al, 2015; Nguyen et al, 2017). Trata-se de vírus pequenos, não envelopados e altamente infecciosos (Teunis et al, 2008). O alto número de vírions nas fezes e no vômito, a alta estabilidade no ambiente, resistência à desinfecção e baixa dose infecciosa são fatores que contribuem para a alta infecciosidade e rápida transmissão do vírus. Soma-se a estas características o fato destes vírus possuirem RNA como genoma, caracterizado por uma rápida evolução por meio de mecanismos de mutação e recombinação (Donaldson et al, 2010). Estes mecanismos garantem a diversidade genética e a emergência de cepas variantes epidêmicas ou pandêmicas, com adaptação ao hospedeiro, escape da resposta imunitária, e consequente sobrevivência na população humana, além de impor um desafio ao desenvolvimento de vacinas eficazes (Bull et al, 2007). Três dentre os dez genogrupos atualmente descritos para o gênero Norovirus, baseando-se na análise de sequência da principal proteína do capsídeo viral (VP1 – ORF2), infectam os seres humanos (GI, GII e GIV) (Kroneman et al, 2013, Chhabra et al, 2019). Os genótipos virais são, por sua vez, determinados baseando-se na sequência completa de VP1 e em sequência parcial da polimerase (ORF1), gerando uma classificação binária para estes vírus, primordial diante dos eventos frequentes de recombinação. A admirável variedade de recombinantes que emergem rapidamente, frequentemente envolvidas em surtos, salienta a importância do monitoramento cuidadoso do surgimento de novas cepas, que poderia facilitar a detecção precoce daquelas com potencial pandêmico. Estudos moleculares são, portanto, importantes para o entendimento do complexo processo de evolução destes vírus e para o rastreio de disseminação de novas cepas com características epidêmicas ou pandêmicas. Por fim, a 2 caracterização molecular das cepas circulantes tem sua aplicabilidade importante para o desenvolvimento de vacinas e de antivirais. 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Breve Histórico Durante décadas pesquisadores tentaram encontrar um agente etiológico para os surtos de gastroenterites agudas não bacterianas, que eram caracterizadas como doenças autolimitadas, com sintomas de diarreia, vômito e dor abdominal. A possível etiologia viral foi demonstrada entre 1945 e 1953 por meio da inoculação de filtrados livres de bactérias em voluntários, que apresentaram os sintomas descritos anteriormente (Reimann et al, 1945; Gordon et al, 1947; Jordan et al, 1953). No período de outubro a novembro de 1968 ocorreu um surto de gastroenterite numa escola na cidade de Norwalk, Ohio, Estados Unidos, em que metade dos alunos e professores desenvolveu gastroenterite e aproximadamente um terço dos familiares também adoeceram. As tentativas iniciais de identificar o agente causador foram fracassadas, porém amostras coletadas de pessoas doentes foram utilizadas como inóculos em estudos experimentais no National Institute of Health (Dolin et al, 1971). Finalmente, em 1972, Kapikian et al, por meio de microscopia eletrônica, identificaram partículas virais nas amostras de voluntários infectados com o inóculo de amostras do surto de Norwalk (Kapikian et al, 1972). O vírus foi chamado agente de Norwalk e se constituiu no primeiro agente infeccioso viral associado à gastroenterite. Estudos posteriores demonstraram outros vírus morfologicamente similares, pequenos e arredondados também associados com gastroenterites (Applleton et al, 1977; Thornhill et al, 1977; Dolin et al, 1982), denominados então small round structured viruses (SRSVs). Sendo assim, a classificação desses vírus foi inicialmente baseada na morfologia ao microscópio eletrônico e o vírus Norwalk foi considerado a cepa protótipo dos SRSVs (Atmar & Estes, 2001). Devido a características das partículas como densidade em gradiente de centrifugação, tamanho e estabilidade ao ácido e éter, o vírus Norwalk e os 3 outros SRSVs foram sugeridos ser classificados como “parvovirus-like” (Dolin et al, 1972). Entretanto, Greenberg et al (1981) propuseram a classificação do vírus Norwalk na família Caliciviridae, baseados na estrutura protéica do vírion. Posteriormente, a classificação do Norwalk como calicivírus foi reforçada por meio da clonagem do genoma, evidenciando seu genoma composto por uma fita simples de RNA de polaridade positiva (Jiang et al, 1990). Outros estudos confirmaram a relação genética entre Norwalk, os outros SRSVs e os calicivírus (Dingle et al, 1995; Lambden et al, 1995; Hardy & Estes, 1996; Seah et al, 1999). Com o avanço na biologia molecular, foi possível a classificação de acordo com o genoma, permanecendo então na família Caliciviridae (Jiang et al, 1990). 2.2 Estrutural viral Os norovírus são vírus redondos, pequenos (~38 nm), não envelopados e de simetria icosaédrica. O genoma é constituído de RNA de fita simples, polaridade positiva, de aproximadamente 7,6 Kb, poliadenilado na extremidade 3’ e na extremidade 5’ possui uma VPg (proteína viral associada ao genoma) ligada covalentemente (Figura 1). O RNA genômico é organizado em três regiões de leitura abertas (ORFs- Open Reading Frames): i) ORF1 codifica uma grande poliproteína não estrutural, que é clivada em várias proteínas não estruturais, essenciais para a replicação viral (NS1-NS7); ii) ORF2 codifica a proteína VP1 (≈60KDa), a principal e maior do capsídeo e; iii) ORF3 codifica VP2, uma proteína pequena também constituinte do capsídeo viral, cujo tamanho varia entre os calicivírus (12 - 29 KDa) (Glass, 2000; Katayama, 2002; Chen et al, 2006). 4 Figura 1. Representação esquemática do genoma dos norovírus. Proteínas não estruturais: P48 (NS1/2), NTPase (NS3), P22 (NS4), VPg (NS5), Pro (NS6) e Pol RNA (NS7). Proteínas estruturais: VP1 e VP2. A poliproteína originada da ORF1 é clivada por uma proteinase 3C-like em pelo menos seis proteínas não estruturais (NS): P48 (NS1/2), NTPase (NS3), P22 (NS4), VPg (NS5), Pro (NS6) e Pol RNA (NS7) (Hardy et al, 2002; Belliot et al, 2003). A RNA polimerase é uma enzima central na replicação do RNA, intimamente relacionado ao “fitness” viral, que é determinado por diversos fatores, como a eficiência da replicação viral e a diversidade genética (Bull et al, 2010). A morfologia dos norovírus é estudada a partir de virus-like particles (VLPs) que são formadas pela expressão de proteínas do capsídeo (VP1) em baculovírus recombinantes e observadas por crio-microscopia eletrônica e por cristalografia de raio X (Figura 2) (Bertolotti-Ciarlet et al, 2002; Chen et al, 2006). P48 NTPase p22 VPg Pro Pol VP1 VP2 ORF 1 ORF 2 ORF 3 N S P1 P1 P2 Shel l Protuding 5374 6950 5358 6950 5’ VPg (A) 3’ 5 Figura 2. Estrutura da virus-like particle do vírus Norwalk. Adaptado: Hutson et al, 2004. O vírion é composto por 90 dímeros da proteína VP1 (Figura 1), que é responsável pela maioria das funções relacionadas ao capsídeo, como montagem, interações com o hospedeiro e imunogenicidade. VP1 pode ser dividida em três domínios: N, S e P (Figura 2). O domínio N (N-terminal) é o mais interno; S (Shell) (resíduos 1-221) forma o núcleo estrutural, é o domínio intermediário e é responsável pela interação intermolecular do capsídeo viral e, sozinho, pode formar partículas icosaédricas lisas (Bertolotti-Ciarlet et al, 2003); o domínio P (protuding) é o domínio mais externo, apresentando uma protrusão em forma de arco emanando da superfície e está envolvido em interações diméricas para estabilizar o capsídeo (Bertolotti-Ciarlet et al, 2003). O domínio P é subdividido em dois subdomínios: P1 e P2 (Figuras 1 e 2) (Prasad et al, 1999). O subdomínio P1 é mais interno (forma a base dos arcos dos capsômeros), possui sequência razoavelmente conservada (Cao et al, 2007) e está implicado na antigenicidade do vírion (Hardy et al, 1996; Hale et al, 2000). O subdomínio P2 está localizado mais externamente (no topo dos arcos), apresentando alta variabilidade, sendo importante na resposta imunitária (Tan et al, 2003; Tan & Jiang, 2005; Cao et al, 2007). 6 No subdomínio P2 estão localizados os principais epítopos responsáveis pelo reconhecimento imunológico do hospedeiro e também os principais domínios de ligação aos diversos receptores HBGAs (Histo-Blood Group Antigens). Mutações no domínio P2 alteram a antigenicidade e a especificidade de reconhecimento pelos HBGAs, caracterizando uma nova cepa (Donaldson et al, 2008; Debbink et al, 2012; Carmona-Vicente et al, 2016). A proteína VP2 parece ter um papel importante na produção de partículas infecciosas, fornecendo suporte estrutural para o capsídeo (Sosnovtsev et al, 2005; Vongpunsawad et al, 2013). Conley et al (2019) sugeriram que VP2 de calicivírus felino (FCV) forma uma espécie de portal que pode servir como um canal para liberação endossomal do genoma viral. 2.3 Classificação De acordo com o ICTV (International Committee on Taxonomy of Viruses), os norovírus pertencem à família Caliciviridae, que é composta de uma ampla variedade de vírus (Vinjé et al, 2019). Vírus pertencentes aos gêneros Lagovirus, Norovirus, Nebovirus, Recovirus, Sapovirus, Valovirus e Vesivirus infectam mamíferos; vírus dos gêneros Bavovirus e Nacovirus infectam aves; enquanto que vírus dos gêneros Minovirus e Salovirus infectam peixes (Atmar & Estes, 2001; Farkas et al, 2008; L’Homme et al, 2009; Day et al, 2010; Wolf et al, 2011; Mikaelsen et al, 2014; Mor et al, 2017). Somente os norovírus e os sapovírus infectam humanos e são importantes agentes causadores de gastroenterite aguda. Os norovírus podem ser classificados em dez genogrupos (GI a GX), baseando-se na análise da sequência de VP1 (ORF2) (Kroneman et al, 2013, Chhabra et al, 2019). Os genogrupos GI, GII e GIV infectam humanos, sendo GI e GII os principais causadores de doença na população (Vinjé, 2015) (Figura 3). Os genogrupos, por sua vez, são subdivididos em diversos genótipos: 49 baseados na sequência completa de VP1 e 60 baseados em sequências parciais da polimerase (Figura 3) (Chhabra et al, 2019). GI e GII compartilham menos de 50% de identidade em VP1 e os genótipos apresentam menos de 20% de homologia (Vinjé et al, 2000; Zheng et al, 2006), destacando a grande 7 diversidade dos norovírus, devido à variação antigênica, que representa um importante obstáculo à imunidade protetora após infecção e vacinação (Mallory et al, 2019). Figura 3. Classificação filogenética baseada nas sequências de VP1 (ORF2). Fonte: Chhabra et al, 2019. Os norovírus são classificados de acordo com o agrupamento filogenético de sequências completas dos aminoácidos de VP1, conforme proposto em 2013 por pesquisadores do NCWG (Norovirus Classification Working Group) 8 (Kroneman et al, 2013). No caso da subtipagem em variantes GII.4, foi decidido que seria baseda no grupamento filogenético e que novas variantes somente seriam reconhecidas depois de se tornarem epidêmicas em pelo menos duas regiões geograficamente diferentes. Além disso, Kroneman et al (2013) propuseram uma nomenclatura padrão universal. A letra “P” passou a ser utilizada para especificar a região da polimerase. Por exemplo, se uma cepa é classificada pela sequência da polimerase como GII.7 e pelo capsídeo como GII.6, sua nomenclatura ficaria GII.P7-GII.6. Quando a sequência ORF-1 não possuía a ORF-2 correspondente conhecida, ela passou a ser chamada de “órfã”, pois poderia associar-se “promiscuamente” com diferentes capsídeos. Genótipos ORF1 órfãos passaram a ser representados preliminarmente por letra minúscula ao invés de números, até a identificação do capsídeo correspondente (Bull et al, 2007; Kroneman et al, 2013), como é o caso de GII.b, que inicialmente foi considerado um recombinante obrigatório (Bruggink et al, 2009; Bruggink et al, 2013) e posteriormente foi renomeado como GII.P21 (Kroneman et al, 2013). Recentemente, Chhabra et al (2019) atualizaram a classificação dos norovírus, acrescentando novos genogrupos e genótipos baseados nas sequências completas de aminoácidos do capsídeo de acordo com critérios outrora estabelecidos por Kroneman et al (2013). Além disso, classificaram sequências de nucleotídeos da região parcial da polimerase em tipos de P, independentemente da classificação do capsídeo (VP1) correspondente eliminando, dessa forma, a designação órfã de ORF1 (por exemplo, a polimerase órfã GII.Pe passou a ser classificada como GII.P31). A nova nomenclatura passa a designar primeiro o nome do capsídeo seguido pelo tipo P, por exemplo, de GII.P16-GII.4 Sydney [P16] para GII.4 Sydney [P16], ou GII.P7-GII.4 para GII.6 [P7]. 2.4 Evolução Os norovírus são considerados vírus de evolução rápida (de Graaf et al, 2016; Parra et al, 2017). Dois mecanismos importantes contribuem para a evolução dos norovírus, implicando em sua extensa variabilidade antigênica: as mutações pontuais e a recombinação (White, 2014). 9 As mutações pontuais constituem um mecanismo importante para a diversidade genética dos norovírus, especialmente no caso de GII.4. Conforme previamente mencionamos, os aminoácidos associados à variação antigênica estão localizados no domínio P da proteína VP1 do capsídeo, que é responsável pela ligação aos receptores HBGAs e aos anticorpos (Debbink et al, 2013). Lindesmith et al (2012) propuseram cinco epítopos hipervariáveis (A a E) para NoV GII.4 em VP1. A recombinação, por sua vez, é gerada quando duas cepas distintas infectam uma mesma célula havendo, durante a replicação, junção de duas regiões diferentes do genoma de ambas, normalmente entre a ORF1 (capsídeo) e ORF2 (polimerase) (Figura 4). Este fenômeno pode ocorrer entre genótipos diferentes (intergenotípica) ou entre cepas de um mesmo genótipo (intragenotípica) (Bull et al, 2005). Apesar de a junção entre a ORF1 e ORF2 ser o sítio mais comum de recombinação, também há relatos de o evento ocorrer eggm sítios menos comuns, como entre ORF2 e ORF3 (Eden et al, 2013) e também na região da polimerase (Siqueira et al, 2016). A recombinação entre as ORF 1 e 2 proporciona troca entre fragmentos do genoma que codica proteínas estruturais e não estruturais, possibilitando aos novos vírus a obtenção de uma polimerase mais eficiente, aumentando a capacidade adaptativa e a virulência (Bull et al, 2007; Rocha Pereira et al, 2016). Ludwig-Begall et al (2019) compararam a dinâmica da recombinação dos norovírus ao cubo de Rubik (conhecido como cubo mágico), em que cada quadrado pode ser articulado para formar parceria com qualquer um dos outros quadrados, podendo gerar inúmeras combinações. 10 Figura 4. Mecanismo de recombinação de norovírus (Adaptado de Graaf et al, 2016). Apesar dos norovírus GI, GII e GIV estarem associados à infecção em humanos, GII são os responsáveis pela maioria das infecções, impulsionados pela variabilidade de cepas dentro do genótipo GII.4. Estudos demonstram que o genótipo GII.4, o mais prevalente no mundo, está evoluindo de modo similar aos vírus influenza H3N2, com substituição temporal de variantes predominantes guiada pela resposta imunitária do indivíduo (Lindesmith et al, 2008; Victoria et al, 2009; Debbink et al, 2013; Thoma et al, 2019). Embora tenha havido um aumento da circulação de GII.17 e GII.2 nos útimos anos (GII.17 entre 2014/2015 e GII.2 entre 2016/2017) (Matsushima et al, 2015; Ao et al, 2017), o genótipo GII.4 persiste na população, sendo responsável por 60 a 80% de todas as infecções causadas pelos norovírus, e por 50-70% dos surtos de norovírus por ano (Siebenga et al, 2009; Tohma et al, 2019). Desde a década de 90, 11 aproximadamente a cada dois ou três anos, mais de dez variantes GII.4 têm sido relatadas, sendo que sete delas apresentaram caráter pandêmico: US95_96, Famington Hills, Hunter, Yerseke, Den Haag, New Orleans e Sydney (Figura 5). As cinco primeiras são resultado de mutações no domínio P do capsídeo e as duas últimas (New Orleans e Sydney), de recombinação entre ORF1 e ORF2 (Eden et al, 2013; White et al, 2014; Carmona-Vicente et al, 2016). Figura 5. Variantes pandêmicas do genótipo GII.4 (Fonte: Vinjé, 2015). Acredita-se também que, assim como acontece com cepas GII.4, o genótipo GII.17 também tenha variantes, pelo fato de haver trocas de aminoácidos nos principais epítopos do capsideo (Debbink et al, 2012). No inverno de 2014-2015, houve um súbito aumento na detecção do genótipo GII.17 em alguns países da Ásia e suspeitou-se que ele substituiria a variante Sydney 2012 (de Graaf et al, 2015; Matsushima et al, 2015). Posteriormente, durante o inverno de 2016-2017 do hemisfério norte, houve a reermengência da recombinante GII.2[P16] em países como Alemanha, China, Taiwan, Hong Kong e Japão, levando a rápido aumento de surtos de gastroenterite por norovírus, substituindo os genótipos GII.4 e GII.17 (Ao et al, 2017; Bidalot et al, 2017; Chan et al, 2017; Niendorf et al, 2017). Em 2016, uma nova recombinante emergiu, constituída de capsídeo similar ao GII.4 Sydney 2012, porém com a polimerase GII.P16 pouco comum. GII.4 Sydney[P16] foi descrita pela primeira vez na cidade de Kawasaki, no Japão (Matsushima et al, 2016), sendo depois detectada em diversos países como Coréia do Sul, Alemanha, Japão, Estados Unidos e Austrália (https://www.cdc.gov/norovirus/reporting/calicinet/data.html; Bidalot et al, 2017; Choi et al, 2017; Lun et al, 2018). Primeiro GII.4 https://www.cdc.gov/norovirus/reporting/calicinet/data.html 12 Considerando a rápida evolução dos norovírus, alavancada especialmente pela frequente recombinação e também pelas mutações, favorecendo sua grande diversidade genética, Thoma et al (2019) destacam a importância da identificação precoce de alterações necessárias para o surgimento de uma nova variante, espécie de “Santo Graal”, para controlar vírus que mudam constantemente. 2.5 Patogênese Apesar da importância dos norovírus no cenário da gastroenterite no mundo, ainda há muitos aspectos sobre a patogênese a serem esclarecidos, devido à falta de um sistema de cultura de células eficiente e facilmente disponível. Há dois sitemas descritos, linhagem de células B e enteróides derivados de células-tronco, porém replicam norovírus humanos em níveis suficientes (Jones et al, 2014; Ettayeb et al, 2016). Recentemente foi descrita replicação eficiente de vários genótipos de norovírus humanos em larva de peixe-zebra (Danio rerio) (Van Dycke et al, 2019), que provavelmente facilitará o estudo da patogênese dos norovírus. A interação entre os norovírus com seus hospedeiros é confusa, uma vez que nem todos os indivíduos são susceptíveis à infecção e nem todos os genótipos são patogênicos da mesma forma. Estudos em voluntários e em animais mostram que há fatores importantes relacionados à patogênese dos norovírus, como a ligação aos HBGAs e a resposta imunitária à infecção (Lindesmith et al, 2003; Friesema et al, 2009). Os HBGAs humanos são carboidratos complexos presentes na superfície das membranas plasmáticas de células de vários tecidos humanos (Le Pendu et al, 2004; Nordgren et al, 2019) e também podem ser encontradas como oligossacarídeos livres em líquidos biológicos como leite, saliva, sangue e conteúdos intestinais (Tan & Jiang, 2005). Os HBGAs são extremamente polimórficos e três principais famílias - Lewis, secretor e ABH - são relacionadas no reconhecimento pelos norovírus (Huang et al, 2003). A síntese dos HBGAs ocorre por meio da ação de enzimas fucosiltransferases, codificadas pelos genes ABH, FUT2 e FUT3, e diferenças na expressão dos HBGAs interferem na 13 susceptibilidade dos indivíduos à infecção pelos norovírus (Marionneau et al, 2002). As famílias dos genes ABH, Lewis e secretor contém alelos silenciosos, podendo levar a fenótipos nulos nos loci como mutações inativadoras em FUT2 que são responsáveis pelo fenótipo não-secretor, encontrado em aproximadamente 20% das populações Norte-americana e Européia (Marionneau et al, 2002). Indivíduos não secretores são caracterizados pela ausência de antígenos ABH na saliva e na maioria das células epiteliais dos tratos digestivo, genitourinário e respiratório (Marionneau et al, 2002), conferindo na maioria das vezes aparente proteção contra infecção por determinados genótipos dos norovírus, como GII.4 (Frenck et al, 2012). De fato, em estudo realizado por nosso grupo de pesquisa, observamos infecção preferencial por norovírus em indivíduos secretores (Vicentini et al, 2013). A proteína do capsídeo VP1 de diferentes genótipos dos norovírus apresenta distintas especificidades de ligação a diversos HBGAs, o que leva a diferenças de susceptibilidade dos indivíduos a cepas específicas de norovírus (Lindesmith et al, 2003). Por exemplo, indivíduos não secretores são aparentemente resistentes à infecção por genótipos como GII.4, GII.3, GI.1 (French et al, 2012; Liu et al, 2015), e podem ser susceptíveis à outras cepas, como GI.3, que, em estudo realizado na Suécia, não mostrou associação entre status secretor e susceptibilidade à infecção (Nordgren et al, 2010). Por conseguinte, alterações (mutações) nos epítopos localizados na proteína VP1, podem levar a modificações tanto na capacidade de ligação dos vírus quanto no reconhecimento pelo sistema imunitário. A imunidade ao norovírus é complexa. A suscetibilidade natural ao norovírus pode variar entre indivíduos e genótipos e a duração e o grau de proteção cruzada da imunidade adquirida não são bem compreendidos (Mattison et al, 2018). A maioria das informações está baseada em estudos com voluntários e em indivíduos envolvidos em surtos de gastroenterites, sugerindo- se repostas imunitárias homólogas após infecção por norovírus em voluntários, entretanto a proteção foi relatada ser curta (semanas a meses) e cepa específica (Parrino et al, 1977; Farkas et al, 2003). Estudos mais recentes estimam duração de imunidade de 4 a 8 anos após a infecção (Simmons et al, 2013). Além disso, não há correlação entre presença de anticorpos e proteção contra infecção, o 14 que explica a grande difusão de infecções por norovírus a cada ano e os múltiplos episódios em um mesmo indivíduo, inclusive na população adulta (Rockx et al, 2005). 2.6 Epidemiologia e aspectos clínicos da infecção Os norovírus infectam pessoas de todas as idades e são causa de gastroenterite em diversos ambientes como escolas, hospitais, casas de repouso, creches e quartéis militares (Westrell et al, 2010; Bányai et al, 2018; Volpini et al, 2019). Eles são considerados a principal causa de surtos e casos esporádicos de gastroenterite no mundo (Ahmed et al, 2014). Estima-se que os norovírus causem 64.000 episódios de diarreia que necessitam de hospitalização, 900.000 episódios que levam a visitas a médicos de crianças de países industrializados e são responsáveis por 212.000 mortes por ano no mundo (Patel et al, 2008; Pires et al, 2015). O grupo referência em epidemiologia sobre doenças transmitidas por alimentos (Foodborne Disease Burden Epidemiology Reference Group - FERG) da OMS estima que os norovírus causaram 684 milhões de casos de gastroenterites no ano de 2010 e foram a principal causa no mundo de doença transmitida por alimentos (Kirk et al, 2015). Os norovírus são transmitidos pela via fecal-oral, por contato entre indivíduos e através da ingestão de alimentos e de água contaminados (Atmar & Estes, 2006). Também há evidências de transmissão pelo ar através de aerossóis produzidos pelo ato de vomitar, forma de transmissão muito comum em hospitais, asilos e navios de cruzeiros (Marks et al, 2000; Marks et al, 2003). A dose infecciosa é baixa, representada por menos de 10 a 100 vírions, conforme dados de estudos experimentais em humanos (Hutson et al, 2004). São vírions resistentes à inativação/desinfecção por desinfetantes normalmente utilizados, como alcoóis e compostos quaternários de amônio, que geralmente são eficazes contra outros vírions e a maioria das bactérias (Kingsley et al, 2014). São classificados como agentes biológicos de classe B por causa da alta estabilidade no ambiente, pela alta infecciosidade, pelo súbito e explosivo 15 estabelecimento dos surtos e pela natureza debilitante da doença (Hutson et al, 2004). A média do período de incubação é de 12-48 h e a média de duração dos sintomas, de 12-72 horas (Graham et al, 1994). Os sintomas apresentados são vômito, diarreia, dor abdominal, febre, cefaleia, mialgia e calafrios. As fezes apresentam-se aquosas, com presença de muco. Pode haver complicações como desidratação, desequilíbrio hidroeletrolítico, insuficiência renal, desnutrição e, em crianças jovens, convulsões benignas (Higuchi et al, 2017; Kim et al, 2018). Recentemente foi relatado o primeiro caso de síndrome hemolítica urêmica em um bebê após infecção por norovírus (Daher et al, 2019). Estudos demonstram um longo tempo de excreção viral, mesmo após a resolução dos sintomas. Há relato de início de excreção viral de 18 horas após inoculação em voluntários e tempo de excreção viral variando de 13 a 56 dias (Okhuysen et al, 1995; Rockx et al, 2002; Atmar et al, 2008). A doença resultante da infecção pelos norovírus foi historicamente descrita como moderada e auto-limitada, com base em estudos de surtos e também em estudos envolvendo voluntários, contudo, os sintomas podem durar mais tempo numa parcela de população, como em crianças, idosos e indivíduos imunocomprometidos (Rockx et al, 2002) e conforme evidenciamos em crianças hospitalizadas em hospital em nossa área geográfica (Ribeiro et al, 2008). No caso de pacientes imunocomprometidos, que podem desenvolver infecção crônica com duração de meses ou até de anos, especula-se que podem funcionar como reservatórios dos vírus, devido à reduzida pressão imunitária (Karst et al, 2014; Vega et al, 2014). Além disso, há evidências de consequências desenvolvidas após infecção por norovírus, como Síndrome do Intestino Irritável e Doença Inflamatória Intestinal, em que os norovírus parecem servir como um “gatilho” dependendo do contexto genético (Marshall et al, 2007; Cadwell, et al, 2010). 2.7 Vacina O desenvolvimento de vacina para os norovírus é dificultado pela grande diversidade genética, pela ausência de um modelo animal e de um sistema 16 eficiente de cultivo. Apesar disso há várias sendo desenvolvidas utilizando diferentes tecnologias, tanto monovalentesde GI.1 quanto bivalentes, baseadas em GI.1 e GII.4, incluindo duas em fase clínica (Debbink et al, 2014; Baehner et al, 2016). . Essas tecnologias incluem VLPs, partículas P e adenovírus recombinantes, que expressam a proteína VP1. Tecnologias envolvendo vírus “mortos” ou atenuados, não foram adotadas devido à falta de um sistema de cultura. A recente descrição de um sistema modelo in vivo para estudar a replicação dos norovírus humanos utilizando larvas de peixe-zebra (Van Dycke et al, 2019) poderá abrir novos caminhos para a pesquisa dos norovírus. As duas vacinas em ensaios clínicos em humanos incluem uma vacina VLP bivalente GI.1 / GII.4 intramuscular nos ensaios de Fase IIb (Takeda et al, 2016) e uma vacina monovalente via oral (comprimido) de adenovírus recombinante que expressa a proteína VP1 GI.1 na Fase I (Tucker et al, 2008). Devido à grande capacidade de evolução dos norovírus, vacinas desenvolvidas provavelmente deverão ser reformuladas a cada determinado período de tempo, semelhante ao que ocorre com as vacinas para o vírus influenza (Graaf et al, 2016). 17 3 OBJETIVOS 3.1 Objetivo Geral Determinar a diversidade genética de norovírus em indivíduos com gastroenterite e comparar com genótipos circulantes previamente em uma mesma área geográfica. 3.2 Objetivos Específicos • Detectar os norovírus em crianças com gastroenterite e descrever sinais e sintomas clínicos das crianças infectadas; • Caracterizar os genótipos e descrever as variantes e recombinantes de norovírus; • Determinar carga viral fecal de cepas recombinantes; • Descrever a variabilidade molecular em sequências da polimerase e do capsídeo de recombinantes emergentes; • Descrever os genótipos de norovírus que circularam em diferentes períodos de tempo em indivíduos infectados, de casos esporádicos e de surto em hospital; 18 4 DADOS COMPLEMENTARES Para melhor compreensão, os resultados referentes aos três primeiros dos cinco objetivos específicos estão descritos no manuscrito publicado intitulado “Detection and molecular characterization of the novel recombinant norovirus GII.P16-GII.4 Sydney in Southeastern Brazil in 2016” (Anexo 3). Resultados referentes ao quinto objetivo específico estão apresentados como forma de manuscrito publicado intitulado “An outbreak due to a norovirus GII.Pe- GII.4 Sydney 2012 recombinant in neonatal and pediatric intensive care units” (Anexo 4) ou escrito para ser submetido à publicação e intitulado “Genetic diversity of noroviruses in different periods of time in all age individuals, Southeastern Brazil.” (Anexo 5). Apresentamos a seguir resultados do estudo desenvolvido que não fazem parte de manuscrito publicado ou escrito. 4.1 Caracterização das amostras do estudo prospectivo Foram obtidas 307 amostras fecais por eliminação espontânea de crianças de ambos os sexos, com até 11 anos de idade (mediana= 16 meses) com sintomas de gastroenterite aguda atendidas predominantemente (91,1%) das amostras) no pronto socorro do Hospital Estadual Infantil Nossa Senhora Glória (HINSG) e no Pronto Atendimento (PA) de São Pedro (n=275), e em outras localidades (8,9%) [PA da Praia do Suá, no Pronto Socorro do Vitória Apart Hospital e internadas no Hospital Universitário Cassiano Moraes (HUCAM)]. Também foram utilizadas amostras cedidas pelo Laboratório Central da Secretaria Estadual de Saúde (LACEN - ES) (Tabela 1). A coleta foi realizada em outubro de 2014 a julho de 2016 e setembro de 2017 a setembro de 2018. Locais de coleta N HINSG 153 PA São Pedro 122 PA Praia Suá 7 Vitória Apart Hospital 2 HUCAM 2 LACEN-ES 21 Total 307 19 Tabela 1. Distribuição do número de amostras fecais obtidas de crianças com diarreia de acordo com o local de coleta. As amostras fecais foram coletadas após obtenção de consentimento livre e esclarecido por parte do responsável e assinatura do Termo de Consentimento (TCLE). Foi aplicado questionário com o responsável pela criança para obtenção de informações referentes aos pacientes como idade, sexo, residência e sintomas (Anexo 1). O TCLE não foi utilizado em relação às amostras obtidas via LACEN, por fazerem parte de uma estratégia de vigilância em DDA (Doença Diarreica Aguda). Aspectos Éticos da Pesquisa Este projeto obteve aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo, parecer número 1.302.166 (Anexo 2). 4.1.2 Distribuição de amostras de fezes e casos de norovírus de acordo com idade das crianças infectadas, local e mês de coleta. A distribuição dos casos positivos para norovírus conforme a idade das crianças pode ser observada na Tabela 2; 31,5% (64/203) das crianças até os 24 meses de vida e 10,6% após os 24 meses tiveram a infecção pelo norovírus. A distribuição de casos positivos para norovírus em relação ao local de coleta e número de amostras coletadas pode ser observado na Tabela 3. Idade (meses) Total de amostras Norovírus + n (%) 0 a 6 50 8 (16) 7 a 12 68 34 (50) 13 a 18 56 14 (25) 19 a 24 29 8 (27,5) > 24 104 11 (10) Total 307 75 (24,4) Tabela 2. Idade estratificada para crianças positivas para norovírus. 20 Locais de coleta Quantidade de amostras coletadas Norovírus n (%) HINSG 153 36 (23,5) PA São Pedro 122 26 (21,3) PA Praia Suá 7 0 Vitória Apart Hospital 2 1 LACEN-ES 21 10 (47,6) HUCAM 2 2 Tabela 3. Total de amostras e frequência de norovírus por local de coleta. Os casos positivos para norovírus foram detectados durante todo o período de coleta, sendo mais frequentes entre os meses de março a junho do ano de 2015, fevereiro a junho de 2016 e março a julho de 2018, coincidindo com a maior frequência de coleta das fezes (Figura 1). Figura 6. Distribuição dos casos positivos de NoV de acordo com os meses de coleta. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 casos norovírus casos rotavírus total amostras 21 4.1.3 Principais manifestações clínicas Manifestações clínicas Presença Sim n (%) Não n (%) Sem informação n (%) Diarreia 66 (88) 1 (0,1) 8 (10,6) Vômito 57 (76) 10 (13,3) 8 (10,6) Febre 35 (46,6) 31 (41,3) 9 (12) Sintomas respiratórios 49 (65,3) 14 (18,6) 12 (16) Dor abdominal 27 (36) 37 (49,3) 11 (14,6) Tabela 4. Principais manifestações clínicas nas 75 crianças positivas para norovírus. 4.1.4 Distribuição dos genótipos de norovírus por mês de coleta Figura 7. Distribuição dos genótipos de norovírus de acordo com os meses de coleta. 0 2 4 6 8 10 N ú m er o d e ge n ó ti p o s Mês de coleta GII.3[P16] GII.6[P7] GII.4Sydney[P31] GII.1[Pg] GII.4Sydney[PNA] GII.17[P17] GII.4Sydney[P16] 0 2 4 6 8 10 o u t/ 1 7 n o v/ 1 7 d e z/ 1 7 ja n /1 8 fe v/ 1 8 m ar /1 8 ab r/ 1 8 m ai /1 8 ju n /1 8 ju l/ 1 8 ag o /1 8 N ú m er o d e ge n ó ti p o s Mês de coleta GII.6[P7] GII.17[P17] GII.4Sydney[P4NO] GII.2[P16] GI.7[P7] GII.4Sydney[P16] 22 4.1.5 Quantificação de RNA viral nas fezes Foi realizada a quantificação de RNA viral em 50 amostras de fezes positivas para norovírus. A quantidade de RNA viral nas fezes variou de 20,93x106 a 92,28x1010 cópias de RNA por gramas de fezes (Tabela 5 e Figura 8). Genótipos n Variação carga viral (log10 / g de fezes) GII.4Sydney[P31] 10 9,74 - 11,96 (mediana=10,46) GII.4Sydney[P16] 22 7,32 - 11,58 (mediana=9,46) GII.17[P17] 3 8,17 - 10,04 GII.3[P16] 2 11,17 e 11,44 GII.6[P7] 1 10,82 GII.1[Pg] 1 10,02 GII.4Sydney[PNA] 1 11,45 GII.NA 10 7,82 - 10,08 (mediana=9) Tabela 5. Faixas de quantificação viral em logaritmo / g fezes. 23 Figura 8. Quantidade de cópias de RNA viral nas amostras fecais dos genótipos GII.4 Sydney [P31] e GII.4 Sydney [P16]. 4.2 Análise molecular da polimerase quase completa e do capsídeo completo (VP1) Com o objetivo de analisar se havia modificação em sequência de nucleotídeos na polimerase GII.P16 que emergiu em 2016 associada aos capsídeos GII.4 Sydney 2012 e GII.2 em relação às previamente circulantes no mundo, elas foram submetidas ao sequenciamento da região quase completa de três amostras selecionadas, sendo duas GII.P16 recombinadas com capsídeo GII.4 Sydney 2012 (detectadas em 2016) e uma com capsídeo GII.2 (detectada em 2017) (Tabela 6). A fim de verificar se ocorreram variações em sequência de nucleotídeos em gene da proteína VP1 na variante GII.4 Sydney 2012, detectados em diferentes períodos de tempo em nossa área geográfica, os capsídeos completos foram comparados com sequências do GenBank, especialmente na região do domínio P2. Selecionamos para este estudo, cinco amostras que tiveram a ORF-2 (VP1) completa sequenciada, detectadas nos anos de 2015, 2016 e 2018 associadas aos capsídeos GII.P31, GII.P16 e GII.P4 New Orleans (Tabela 7). Ano Polimerase P16 recombinante N º de amostras 2016 GII.4 Sydney[P16] 2 2017 GII.2[P16] 1 Tabela .6 Amostras selecionadas para análise de polimerase quase completa. 24 Ano VP1 (ORF-2) recombinante N º de amostras 2015 GII.4 Sydney 2012[P31] 1 2016 GII.4 Sydney[P16] 2 2018 GII.4 Sydney[P16] 1 2018 GII.4 Sydney[P4 New Orleans] 1 Tabela 7. Amostras selecionadas para análise de ORF2 completo. 4.2.1 Sequenciamento - Polimerase quase completa e VP1 Para o sequenciamento da polimerase quase completa foram amplificados dois fragmentos utilizando dois pares de iniciadores: NV6F/NV6R e NV4611/G2SKR (Tabela 8). Para sequenciar o capsídeo completo foram amplificados três fragmentos utilizando três pares de iniciadores: ORF2-F1/ORF2-R1, EVP2F/EVP2R, ORF2- F2/ORF2-R2 (Tabela8). Em todas as PCRs o cDNA (5 μL) foi adicionado a um volume final de reação de PCR de 25 l contendo 1,5 mM de MgCl2, 200 M de cada dNTP (Invitrogen), 160 nM de cada iniciador, 1 unidade de Taq DNA polimerase Platinum (Invitrogen®) e tampão de reação (20 mM de tris-HCl pH 8,4, 50 mM de KCl). A amplificação foi realizada com desnaturação 95°C/15 minutos, seguido de quarenta ciclos 95°C/1min, 50°C/1min e 72°C/1min, com extensão final a 72°C por 10min. Os amplicons de 865 pb e 1051 pb (polimerase quase completa) e 943 pb, 672 pb e 945 pb (VP1 completa) obtidos nas PCRs foram purificados utilizando a enzima ExoProStarTM (GE Healthcare). Os produtos de PCR purificados foram sequenciados utilizando um ABI Prism 310 Genetic Analyzer e Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v.3.1 (Applied Biosystems) utilizando os iniciadores forward (NV6F ou NV4611) e reverse (NV6R ou G2SKR) utilizados 25 nas reações de amplificação. A purificação dos produtos de reação do sequenciamento foi realizada por precipitação com etanol e EDTA. Região Iniciador Sequence 5’ – 3’ Sense Localizações Referência Polimerase quase completa NV6F AGCACCAAGACGAAATTCTGGAG + 3638–3660a Chhabra et al, 2010 NV6R ATGGAGTTCCATTGGGAGGTGCA - 4481–4503a Chhabra et al, 2010 NV4611 CWGCAGCMCTDGAAATCATGG + 4338–4358a Yuen et al, 2001 G2SKR CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT - 5367-5389a Kojima et al, 2002 Capsídeo (VP1 completa) ORF2-F1 AAGAGCCAATGTTCAGATGGa + 5054-5023b Kim et al, 2014 ORF2-R1 CTCTGAAGGTGCAGATGTTa - 5928-5946b Kim et al, 2014 EVP2F GTR CCR CCH ACA GTT GAR TCA + 5730-5750 Vega et al, 2011 EVP2R CCG GGC ATA GTR GAY CTR AAG AA - 6381-6402 Vega et al, 2011 ORF2-F2 AACATCTGCACCTTCAGAGa + 5928-5946b Kim et al, 2014 ORF2-R2 GAAGCCTGTTGTAGATTGCTa - 6854-6873b Kim et al, 2014 Tabela 8. Lista dos iniciadores utilizados na análise. a Genomic locations of the Lordsdale Virus genome (X86557) b Genomic locations of the Farmington Hills (AY502023) 4.2.2 Análise Filogenética As sequências de nucleotídeos obtidas no estudo foram editadas utilizando o BioEdit Sequence Alignment Editor (Hall, 1999). Posteriormente, a sequências de 1.622 nt (VP1 completa) e de 1464 nt (polimerase quase completa) foram alinhadas utilizando o programa SeaView v.4.5.4 (Gouy et al, 2010). As sequências foram, então, comparadas com sequências disponíveis no 26 GenBank, assim como sequências referências de cada genótipo. As árvores filogenéticas das sequências da polimerase quase completa e do capsídeo completo (VP1) foram construídas utilizando o programa MEGA versão 3.1 (Kumar et al, 2004) pelo método maximum likelihood, com a distância genética calculada pelo modelo Kimura parâmetro utilizando 2000 pseudo-réplicas (Figuras 9 e 10). Figura 9. Análise filogenética de sequências completas da proteína VP1 completa do capsídeo GII.4. As cepas pertencentes ao estudo estão marcadas com círculo preto. A cepas referências foram obtidas no GenBank e estão identificadas com o respectivo número de acesso, seguido do país e ano de detecção. 27 Figura 10. Análise filogenética de sequências quase completas da polimerase GII.P16. As cepas pertencentes ao estudo estão marcadas com círculo preto. A cepas referências foram obtidas no GenBank e estão identificadas com o respectivo número de acesso, seguido do país e ano de detecção. 28 4.2.3 Análise da variação de aminoácidos 4.2.3.1 Capsídeo (VP1 completa) Sequências completas da proteína VP1 foram alinhadas e comparadas com sequências das cepas protótipo obtidas no GenBank para a verificação da ocorrência de variação antigênica, especialmente nos sítios putativos antigênicos (epítopos A-E e G) e nos sítios de ligação aos HBGAs. A) B) Capsídeo GII.4 (VP1) Ano S* P2 P1 119 145 174 NERK B A D 540 310 333 373 393 GII.4 New Orleans 2009 (GU445325) 2009 I I S S V N S L GII.4 Sydney2012[P31] (JX459908) 2012 V V P D V R G V GII.4 Sydney2012[P16] (LC175468) 2016 I I S N M H S V GII.4 Sydney 2012[P31] (NR11) 2015 V V P N M H S L GII.4 Sydney[P16] (NR99/NR147) 2016 I I S N M H S V GII.4 Sydney[P16] (297) 2018 I I S N M H S V GII.4 Sydney2012[P4 New Orleans] (262) 2018 V V P N M H S V Figura 11. Variação antigênica nos capsídeos GII.4. (A) Posições dos aminoácidos de VP1 onde ocorreram substituições. (B) Comparação entre os 333 310 373 393 29 capsídeos GII.4 circulantes com as cepas protótipo. Linhas em cinza: cepas referência. *S: domínio S de VP1; P1 e P2: subdomínios do domínio P de VP1. Capsídeo GII.4 Sydney 2012 associado a polimerase GII.Pe que circulou em 2015 foi comparado com o capsídeo protótipo (JX459908). Foram observadas mutações em cinco posições: 310, 333, 373, 393, 540, enquanto o domínio S permaneceu conservado (Figura 3). Capsídeo GII.4 Sydney 2012 associado a polimerase GII.P16 que emergiu em 2016 foi comparado com o capsídeo protótipo Sydney 2012 (JX459908). Foram observadas mutações em oito posições: 119, 145, 174, 310, 333, 373, 393, 540. Resíduos no domínio S reverteram para sequência encontrada no capsídeo de New Orleans 2009 (variante anterior a Sydney 2012) (Figura 11). 4.2.3.2 Polimerase quase completa Sequências quase completas da polimerase (~477 aa) foram alinhadas e comparadas com sequências referências obtidas no GenBank para a verificação da ocorrência de variação antigênica, especialmente nas regiões descritas por Ruis et al (2017). Foram observadas mutações quatro mutações no domínio de palma (293, 332, 357 e 360) e uma mutação no domínio de dedo (173) (Figura 12). A) Domínio de palma Domínio de dedos Domínio de polegar Sítios onde ocorreram trocas que originaram o clado GII.P16 (GII.4Sydney) 30 B) Figura 12. Substituições de aminoácidos observadas na região da polimerase das amostras de 2016 em comparação com cepas referências anteriores ao ano de 2015. 5 DISCUSSÃO Os norovírus são atualmente reconhecidos como os principais agentes causadores de casos esporádicos de gastroenterite no mundo (Patel et al, 2009). São vírus de rápida evolução, devido principalmente aos mecanismos de mutação, responsáveis pelo surgimento de variantes, e de recombinação, principalmente entre ORF1-ORF2 (Cuevas et al, 2016; de Graaf et al, 2016). Em nosso estudo, descrevemos o predomínio de infecção por norovírus em crianças com gastroenterite esporádica em relação aos rotavírus (24,5% versus 11,%) e uma ampla diversidade de genótipos em diferentes períodos de tempo. Destacamos ainda a detecção de genótipos emergentes na população e de mutações nos genes que codificam a polimerase GII.P16 com diferentes capsídeos virais (GII.4 Sydney 2012 e GII.2) e no capsídeo viral GII.4 Sydney 2012 com diferentes polimerases (GII.P16 e GII.P4 New Orleans 2009), revelando sua notável diversidade genética. Cepas Posições na região da polimerase Dedo Palma 173 293 332 357 360 LC175468 E T I Q A KX907727 E T I Q A AY772730 (2000) D S V K T LC145787 (2012) D S V K T KF944110 (2011) D S V K T NR99 (2016) E T I Q A NR147 (2016) E T I Q A 211 (2017) E T I H A 31 Norovírus do genogrupo GII foram os mais frequentes, com apenas uma cepa GI (GIP7-GI.7) encontrada, o que corrobora com outros estudos, em que GII é reconhecido como o genogrupo mais prevalente no Brasil e no mundo (Barreira et al, 2010; Vega et al, 2014; Fumian et al, 2016; O’Ryan et al, 2016; Cantelli et al, 2019). Refletindo a diversidade genética dos norovírus que circulam na população, detectamos seis diferentes capídeos GII (GII.3, GII.6, GII.4 Sydney 2012, GII.17 e GII.1) e cinco diferentes polimerases (GII.P16, GII.P7, GII.Pe, GII.Pg, GII.P17) entre os anos 2014 a 2018. Entre os genótipos do capsídeo, GII.4 foi o mais prevalente na população (76,9%), o que é corroborado por estudos mundiais (Siebenga et al, 2009; Cannon et al, 2017; Lun et al, 2018). A partir de 1990 são descritas seis variantes pandêmicas GII.4, que emergem a cada 2 ou 3 anos, sendo que a mais recente GII.4 Sydney, associada com a polimerase GII.Pe (GII.4 Sydney[P31]), tem predominado no mundo desde 2012, causando surtos e casos esporádicos de gastroenterite (van Beek 2013; Vinjé et al, 2015). GII.4 Sydney[P31] foi detectada em várias regiões do Brasil desde sua emergência (Bittencurt et al, 2019; Cantelli et al, 2019; Dabila et al, 2019). Em nossa área geográfica, esta variante foi reponsável por um surto em unidades pediátricas de um hospital em 2012, mesmo ano do seu primeiro relato o mundo (van Beek et al, 2013; Volpini et al, 2019- Anexo 4). Observamos que esta recombinante predominou durante todo o ano de 2015 entre as amostras do estudo, quando, no início de 2016, esta variante (GII.4 Sydney 2012) emergiu em nossa área geográfica recombinada com a polimerase GII.P16 (GII.4 Sydney 2012[P16]), aparentemente substituindo a recombinante prévia (GII.4 Sydney 2012[P31]), sendo pela primeira vez relatada no Brasil (Barreira et al, 2017 – Anexo 3). Embora o primeiro relato no mundo desta nova recombinante tenha ocorrido em 2016 no Japão (Matsushima et al, 2016), posteriores estudos mostraram seu início de circulação em 2015 com subsequente disseminação nos anos seguintes em diversos países, como EUA, Austrália, Nova Zelândia, Canadá e Coréia do Sul, França e Itália (Bidalot et al, 2017; Cannon et al, 2017; Ruis et al, 2017; Lun et al 2018; Medici et al, 2018; Hasing et al, 2019). Recentemente, GII.4 Sydney[P16] foi detectada em um surto ocorrido numa creche em nossa região em março deste ano de 2019 (Dr Túlio 32 Fumian- comunicação pessoal), afetando também pessoas próximas das crianças e dos funcionários infectados indicando que esta recombinante se mantém na população. Posteriormente, em 2018, encontramos o capsídeo GII.4 Sydney 2012 em associação com a polimerase GII.P4 New Orleans 2009 (variante anterior a Sydney 2012). Esta recombinante (GII.4 Sydney 2012[P4 New Orleans 2009]) tem sido relatada em diversos países como Austrália, Canadá, EUA, Africa do Sul (Mans et al, 2014; Cannon et al, 2017; Lun et al, 2018; Hasing et al, 2019), porém, no Brasil, ela ainda não foi descrita (Barreira et al, 2019 – Anexo 5). Neste cenário, pode-se observar dois eventos separados de recombinação em que o capsídeo GII.4 Sydney foi mantido, levando ao surgimento de GII.4 Sydney[P4 New Orleans 2009] e GII.4 Sydney 2012[P16], e favorecendo a manutenção do capsídeo GII.4 Sydney na população, conforme sugerido por Lun et al (2019). Por sua vez, a polimerase GII.P16, além de recombinada com GII.4 Sydney 2012, também foi encontrada entre nossas amostras com os capsídeos GII.3 entre 2014-2015 e, mais recentemente (2018), também com GII.2. A recombinante GII.2[P16] tem sido descrita desde 2009 (Iritani et al, 2012), todavia, entre 2016 e 2017, reemergiu causando súbito aumento de surtos na China, Hong Kong e Alemanha, sendo detectada também no Japão, EUA, França e Austrália (Ao et al, 2017; Bidalot et al, 2017; Cannon et al, 2017; Chan et al, 2017; Lun et al, 2018; Niendorf et al, 2017). No Brasil, recentemente foi relatada, pela primeira vez por Cantelli et al (2019) associada à diarreia em crianças na comunidade de Manguinhos, Rio de Janeiro. É interessante notar que a análise filogenética da polimerase GII.P16, compartilhada pelos capsídeos GII.4 Sydney 2012 e GII.2, mostrou seu agrupamento junto com as polimerases GII.P16 mais recentes, que reemergiram em 2015. Ao contrário, a GII.P16 detectada entre 2014-2015, associada ao capsídeo GII.3, formou em um cluster separado (Dados complementares). Estudos moleculares que analisaram as cepas reemergentes GII.2[P16] e emergentes GII.4 Sydney 2012[P16] encontraram cinco mutações conservativas na região da polimerase GII.P16 em relação à circulação prévia em 2015, quatro delas no domínio de palma, onde se encontra o sítio catalítico da referida enzima 33 (Ao et al, 2018; Barclay et al, 2019; Cannon et al, 2017; Ruis et al, 2017; Lun et al, 2019; Tohma et al, 2017). Estas mesmas mutações foram encontradas no nosso estudo. Em que pese a pequena quantidade de mutações, tais alterações poderiam ter modificado a fidelidade da polimerase. No caso de GII.2[P16], os estudos sugeriram que não houve mutações no capsídeo GII.2 que poderiam explicar o aumento repentino de sua predominância. De fato, a polimerase tem um papel importante no “fitness” viral, aperfeiçoando (impactando positivamente) a replicação e a transmissão virais (Bull et al, 2010; Arias et al, 2016). Bull et al (2010) descreveram que mutações únicas podem afetar as propriedades biológicas de polimerases da linhagem GII.4 e, curiosamente, uma das mutações (S293T) encontradas na GII.P16 emergente (incluindo as do nosso estudo) possui localização muito próxima ao resíduo 291, que Bull et al demonstraram que altera a cinética de polimerases associadas à GII.4 (Bull et al 2010). No tocante à proteína completa do capsídeo (VP1) da cepa emergente GII.4 Sydney 2012[P16], observamos pequenas diferenças ao compararmos com a cepa protótipo (JX459908), as quais também foram relatadas por Lindesmith et al (2018) e Lun et al (2019). No epítopo A, relacionado à ligação de anticorpos neutralizantes e à emergência de novas variantes GII.4 (Lindesmith et al, 2012; 2018), observamos apenas uma mutação (373). No epítopo D, onde estão localizados os sítios de ligação aos HBGAs, também encontramos apenas uma mutação (393). Além disso, observamos uma mutação na posição 310, na qual está localizado o motivo NERK, que regula a conformação estrutural do capsídeo, cuja nova geometria molecular, em tese, dificultaria o acesso aos epítopos. Também observamos mutações no domínio S (119, 145 e 174) assim como Cannon et al (2017). Contudo, Barclay et al (2019), no que se refere à VP1, não encontraram nenhuma mutação, Dessa forma, no caso da recombinante GII.4 Sydney 2012[P16], temos duas peculiaridades: (i) a aquisição da polimerase GII.P16 exibindo algumas alterações genéticas quando comparadas à polimerase pré-2015, (ii) e algumas mutações na proteína VP1 do capsídeo. Além disso, detectamos a cepa emergente GII.17[P17] em 2016 e em 2018. Esta recombinante emergiu entre 2014-2015 como a principal causa de surtos de gastroenterite na China e no Japão e suspeitou-se que estaria 34 substituindo a variante Sydney 2012 em alguns lugares da Ásia (de Graaf et al, 2015; Matsushima et al, 2015). Desde então tem sido detectada em várias partes do mundo, porém em baixa prevalência. No Brasil, é detectada desde 2015, também em baixa prevalência (Andrade et al, 2017; Silva et al, 2017; Cantelli et al, 2019). É digno de nota que GII.6[P7] – uma recombinante não-GII.4 –detectada em 2014 e 2018, foi também observada em 2004 e 2008 em nossa área geográfica (Anexo 5). Esta recombinante possui ampla distribuição geográfica, sendo detectada em diversos países nos últimos anos como EUA, Itália, China, Japão, África do Sul, Burkina Faso, Austrália, Uruguai, Finlândia (Yang et al, 2016; Wu et al, 2015; Mans et al, 2014; Huynen et al, 2013; Fajardo et al, 2014; Bruggink et al, 2016; Puustinen et al, 2011). No Brasil, ela foi detectada em diversas regiões, sendo responsável por casos esporádicos e também surtos de gastroenterites (Cantelli et al, 2019; Fumian et al, 2016; Gondim et al, 2018; Hernandez et al, 2016). Em nosso estudo, as cepas GII.6[P7], tanto na análise da polimerase quanto do capsídeo foram subdivididas em três clusters, sugerindo variabilidade genética entre elas. Os vírus GII.6 foram demonstrados distribuídos nos três grupos, GII.6a, GII.6b e GII.6c (Chan-It et al ,2012; Vinjé et al; 2015). Diakoud et al (2019) sugeriram a ocorrência de múltiplos eventos de recombinação entre GII.P7 e GII.6, em contraposição a uma possível evolução linear derivada de um ancestral comum GII.6[P7]. Além disso, Dong et al (2019) observaram variação nos aminoácidos na proteína do capsídeo VP1. É importante destacar que observamos a presença desta recombinante em nossa área geográfica em diferentes períodos de tempo, entre 2004 e 2018, em clusters distintos em ambos polimerase e capsídeo, sugerindo que, semelhante à linhagem GII.4, as variantes de GII.6 podem ser substituídas ao longo do tempo, conforme observado por Diakoudi et al (2019). Sendo assim, pode-se inferir que esta recombinante GII.6[P7] está em rápida evolução, tentando permanecer na população, requerendo uma atenção em relação circulação deste genótipo e também em relação às suas variações antigênicas. 35 A dinâmica circulação dos genótipos de norovírus pode também ser evidenciada na análise de amostras obtidas de indivíduos de nossa área geográfica obtidas em estudos prévios (Anexo 5). Além da recombinante GII.6[P7], anteriormente mencionada, destacamos a presença das variantes de GII.4 Kaiso 2003, Farmington Hills, Deng Haag 2006b e Yerseke 2006a, coincidindo com a descrição destas no mundo, com aparente substituição sequencial de uma pela outra, além da ausência de todas estas no período recente (2014-2018), no qual a variante Sydney 2012 foi a única observada (Anexo). Nosso estudo ilustra a notável diversidade genética dos norovirus, em que detectamos grande variedade de cepas, refletindo sua complexa dinâmica epidemiológica. Estudos moleculares são essenciais para detectar de forma precoce novas cepas emergentes. O conhecimento das cepas circulantes na população é importante no desenvolvimento e avaliação da eficácia de vacinas e antivirais. 36 6 CONCLUSÕES • Os norovírus foram causa importante de gastroenterite com vômito e diarreia como as principais manifestações clínicas observadas; • Foi detectada uma grande diversidade de genótipos circulantes: GII.4 Sydney[P16], GII.4 Sydney[P31], GII.17[P17], GII.2[P16], GII.6[P7], GII.3[P16], GII.4 Sydney[PNA], GII.1[Pg], GII.4 Sydney[P4 New Orleans] e GI.7[P7]; • A recombinante emergente GII.4 Sydney[P16] foi pela primeira vez relatada no Brasil; • Foram detectadas diferentes variantes GII.4 em todos os períodos de coleta de amostras; • A carga viral não diferiru entre a cepa emergente recombinante de norovírus GII.4 Sydney[P16] que substituiu a anterior GII.4 Sydney [P31]; • Houve variabilidade de aminoácidos na proteína principal do capsídeo, VP1, de cepas GII.4 Sydney 2012 associadas com GII.P16 (2016 e 2018) em comparação com aquelas que circularam antes de 2015 (associadas com GII.Pe); • A recombinante GII.Pe-GII.4 Sydney 2012 foi a responsável pelo surto em unidade intensiva neonatal em hospital ocorrido em 2012. 37 7 REFERÊNCIAS ABU DAHER G, et al. 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