UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA Biofluidos e espectrometria de massas para triagem de pacientes para COVID-19 Biofluids and Mass Spectrometry for COVID-19 Patient Screening Camila Medeiros de Almeida Tese de Doutorado em Química VITÓRIA 2024 CAMILA MEDEIROS DE ALMEIDA Biofluidos e espectrometria de massas para triagem de pacientes para COVID-19 Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Química do Centro de Ciências Exatas da Universidade Federal do Espírito Santo como requisito parcial para obtenção do Título de Doutora em Química Área de Concentração: Química Linha de Pesquisa: Química Analítica Orientador: Prof. Dr. Wanderson Romão Coorientador: Prof. Dr. José Geraldo Mill VITÓRIA 2024 Ficha catalográfica disponibilizada pelo Sistema Integrado de Bibliotecas - SIBI/UFES e elaborada pelo autor A447b Almeida, Camila Medeiros de, 1991- AlmBiofluidos e espectrometria de massas para triagem de pacientes para COVID-19 / Camila Medeiros de Almeida. - 2024. Alm147 f. : il. AlmOrientador: Wanderson Romão. AlmCoorientador: José Geraldo Mill. AlmTese (Doutorado em Química) - Universidade Federal do Espírito Santo, Centro de Ciências Exatas. Alm1. Química analítica. 2. Espectrometria de massa. 3. Quimiometria. 4. COVID-19. I. Romão, Wanderson. II. Mill, José Geraldo. III. Universidade Federal do Espírito Santo. Centro de Ciências Exatas. IV. Título. CDU: 54 BIOFLUIDOS E ESPECTROMETRIA DE MASSAS PARA TRIAGEM DE PACIENTES PARA COVID-19 Camila Medeiros de Almeida Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em Química do Centro de Ciências Exatas da Universidade Federal do Espírito Santo como requisito parcial para a obtenção do Grau de Doutor(a) em Química. Aprovada em 28/02/2024 por: ________________________________________________ Prof.(a) Dr.(a) Wanderson Romão Orientador(a) UFES ________________________________________________ Prof.(a) Dr.(a) José Geraldo Mill Coorientador(a) UFES ________________________________________________ Prof.(a) Dr.(a) Andrea Rodrigues Chaves UFG ________________________________________________ Prof.(a) Dr.(a) Luciene Cristina Gastalho Campos UESC ________________________________________________ Prof.(a) Dr.(a) Alvaro Cunha Neto UFES ________________________________________________ Prof.(a) Dr.(a) Paulo Roberto Filgueiras UFES Universidade Federal do Espírito Santo Vitória, fevereiro de 2024 Documento assinado eletronicamente nos moldes do art. 10 da MP 2200/01 e Lei 14063/20 [Hash SHA256] 5148c74103666898293bc3ecff8edc1662fb025b9d7710b091efe9fff8291e66 Datas e horários baseados em Brasília, Brasil Sincronizado com o NTP.br e Observatório Nacional (ON) em Os registros de assinatura presentes nesse documento pertencem única e exclusivamente a esse envelope. Documento final gerado e certificado por Documento em conformidade com o padrão de assinatura digital ICP-Brasil e validado de acordo com o Instituto Nacional de Tecnologia da Informação Universidade Federal do Espírito Santo 11/03/2024 às 20:33:41 DocumentosBancaDefesaDoutorado_Camila Medeiros de Almeida Data e Hora de Criação: 29/02/2024 às 10:15:47 Documentos que originaram esse envelope: - FolhaAssinaturas_Camila Medeiros de Almeida.pdf (Arquivo PDF) - 1 página(s) - FolhaRegistro_Camila Medeiros de Almeida.pdf (Arquivo PDF) - 1 página(s) - AtaAprovação_Camila Medeiros de Almeida.pdf (Arquivo PDF) - 1 página(s) Hashs únicas referente à esse envelope de documentos [SHA256]: 5148c74103666898293bc3ecff8edc1662fb025b9d7710b091efe9fff8291e66 [SHA512]: 4d40e2bf3dd7446de2856ef43cc540fd0c482a6f48e7105555e9aadcf524eb94c5c9f593edb59867cfa395875c726c71542fc99542700b06d15ffcb91bc7b223 Lista de assinaturas solicitadas e associadas à esse envelope ASSINADO - Alvaro Cunha Neto (alvarocunhaneto@gmail.com) Data/Hora: 01/03/2024 - 08:23:05, IP: 200.137.65.106 [SHA256]: 62bf7147435998685bba219474e760ac70b72c7ecf5a2930e1548638532b261a ASSINADO - Andrea Rodrigues Chaves (andrea_chaves@ufg.br) Data/Hora: 29/02/2024 - 19:09:05, IP: 177.158.31.222, Geolocalização: [-16.729204, -49.266585] [SHA256]: b8f05058a65fcd17546cd6500b0487d564400e64df43682bcb9c385374025240 ASSINADO - José Geraldo Mill (jose.mill@ufes.br) Data/Hora: 01/03/2024 - 20:30:56, IP: 45.236.240.226, Geolocalização: [-3.1028233, -60.023463] [SHA256]: 56b1f58fccc608a48e95175d4b38abc18009756dbf73b9b4b024140d0ee1e27b ASSINADO - Luciene Cristina Gastalho Campos (lcgcluiz@uesc.br) Data/Hora: 11/03/2024 - 20:33:41, IP: 186.218.253.5 [SHA256]: 9427e34711dd29d1850b84bc2fcd0a36c76ebf834c7ad32f34edee32fc323098 ASSINADO - Paulo Roberto Filgueiras (paulo.filgueiras@ufes.br) Data/Hora: 01/03/2024 - 16:50:35, IP: 200.137.65.107, Geolocalização: [-20.286241, -40.301194] [SHA256]: a287803d5612e1c206df9bf8a4f5e448288ee384df48b5fc9582a822a48472b4 ASSINADO - Wanderson Romão (wandersonromao@gmail.com) Data/Hora: 01/03/2024 - 06:56:27, IP: 179.102.134.228, Geolocalização: [-20.275061, -40.284465] [SHA256]: e48d8cf783d7fab76e896503fd0ead0350bfeb64e6c789bca7af768c5666c171 Histórico de eventos registrados neste envelope 11/03/2024 20:33:42 - Envelope finalizado por lcgcluiz@uesc.br, IP 186.218.253.5 11/03/2024 20:33:42 - Assinatura realizada por lcgcluiz@uesc.br, IP 186.218.253.5 11/03/2024 20:33:22 - Envelope visualizado por lcgcluiz@uesc.br, IP 186.218.253.5 01/03/2024 20:30:56 - Assinatura realizada por jose.mill@ufes.br, IP 45.236.240.226 01/03/2024 20:30:42 - Envelope visualizado por jose.mill@ufes.br, IP 45.236.240.226 01/03/2024 16:50:35 - Assinatura realizada por paulo.filgueiras@ufes.br, IP 200.137.65.107 01/03/2024 16:49:55 - Envelope visualizado por paulo.filgueiras@ufes.br, IP 200.137.65.107 01/03/2024 08:23:05 - Assinatura realizada por alvarocunhaneto@gmail.com, IP 200.137.65.106 01/03/2024 06:56:27 - Assinatura realizada por wandersonromao@gmail.com, IP 179.102.134.228 29/02/2024 19:09:05 - Assinatura realizada por andrea_chaves@ufg.br, IP 177.158.31.222 29/02/2024 16:55:58 - Envelope registrado na Blockchain por michel.chaves@ufes.br, IP 200.137.65.102 29/02/2024 16:55:57 - Envelope encaminhado para assinaturas por michel.chaves@ufes.br, IP 200.137.65.102 29/02/2024 10:15:49 - Envelope criado por michel.chaves@ufes.br, IP 200.137.65.102 Dedico esse trabalho à minha amada família e às famílias de todos aqueles que perderam suas vidas por conta da doença COVID-19. AGRADECIMENTOS A Deus que me deu força para que eu não desistisse no meio do caminho, que foi meu consolo quando as coisas davam errado e minha gratidão quando eu encontrava o caminho certo. O meu maior companheiro durante toda essa nova e desafiante caminhada. Aos meus pais, Lucas e Valéria, que me deram a vida e me ensinaram a desfrutá-la com dignidade e bondade, sempre apoiando todas as minhas escolhas. Vocês são minha base, com quem eu sei que posso contar em todos os momentos. A minha irmã Isabela que me ajudou em vários momentos, juntamente com meu cunhado, Roney, sempre estiveram ao meu lado. Aos meus amigos que tiravam o peso e a aflição quando a ansiedade batia e me mostraram que eu nunca estarei sozinha. Quem tem amigo tem tudo! Ao meu namorado, Bruno, que se tornou o meu melhor amigo. Você não sabe quão mais leve deixou minha caminhada. Te amo! A minha madrinha, Ivana, que mesmo de longe se dedicou para me ajudar nessa etapa final, com todo seu cuidado, também deu um toque especial nesse lindo trabalho. Ao meu orientador, Wanderson Romão, por me apresentar novos caminhos e pessoas incríveis que foram essenciais no desenvolvimento dessa pesquisa e por todos os ensinamentos, sendo o principal o amor pela ciência. E ao meu coorientador José Geraldo Mill por sempre estar disposto a colaborar para o meu desenvolvimento e a conclusão do trabalho. Ao Laboratório Petroleômica e Forense por ser muito mais que um simples grupo de pesquisa, afinal, juntos, dividimos, o espaço, as cobranças, as tristezas, as experiências e principalmente as alegrias. Vocês tornam meus dias mais felizes. Amanda, Luciara, Marcos e Natália, nessa reta final, vocês entraram na minha vida para alegrar, me acalmar e me tranquilizar, com risos, ensinamentos e muito companheirismo. A Larissa obrigada por estar ao meu lado em quase todo doutorado, a você eu tenho muito mais que agradecer, choramos, rimos, brigamos, viajamos, caminhamos e até moramos juntas por um tempo. Você foi a irmã que a pesquisa me deu. Obrigada por acreditar e sempre fazer eu acreditar em mim. Você foi essencial. Agradeço também a Gabriely pela paciência, gentileza e parceria desde o mestrado. Sem vocês duas com certeza esse trabalho não seria concluído. Àqueles que eu conheci no laboratório e ganharam um lugar especial e eterno no meu coração, Bruna, Clebson, Eliane, Flávia, Fernandinha, Iago, Juliana, Lindamara, Natã, Nayara, Radigya, Rayana e Thieres obrigada pela amizade e apoio. E aos alunos novos, obrigada pela confiança e sucesso na caminhada. Agradeço a Ricardo e Almir pela paciência e ensinamentos nas análises realizadas em Goiânia e a Rosiane e José nas análises em Brasília. Aos professores PPGQUI, por todos os ensinamentos, em especial aos professores Álvaro, Valdemar e Paulo que me auxiliaram em diversos momentos. Aos membros da banca, os professores Álvaro, Paulo, Andrea e Luciene, por aceitaram o convite e pelas considerações e pelo acréscimo neste trabalho. A FAPES, CAPES CNPq pelo apoio financeiro. Ao Laboratório Tommasi (Vitória ES), Hospital Vila Velha, Hospital Universitário Cassiano Antônio Moraes, Pronto Atendimento da Glória e Hospital Roberto Arnizaut Silvares pelo fornecimento das amostras e a todos os envolvidos na coleta das amostras. Ao PPGQUI – UFES, especialmente ao coordenador prof Cleocir, por todo suporte durante esses anos. Ao LabPetro e seus funcionários, Suzy, Carlão, Oscar, Cleide e Maria pela atenção e carinho. A todos que em algum momento estiveram presentes, seja com um sorriso, um bom dia ou alguma ajuda para concretizar esse sonho, o meu MUITO OBRIGADA "Os rios não bebem sua própria água; as árvores não comem seus próprios frutos. O sol não brilha para si mesmo; e as flores não espalham sua fragrância para si. Viver para os outros é uma regra da natureza. [...] A vida é boa quando você está feliz; mas a vida é muito melhor quando os outros estão felizes por sua causa". (Papa Francisco) “Coragem. Gentileza. Amizade. Essas são as qualidades que nos definem como seres humanos e nos impulsionam, ocasionalmente, à grandeza.” (Extraordinário) "Devemos manter a nossa certeza de que depois dos dias ruins, os bons virão novamente." (Marie Curie) LISTA DE FIGURAS Figura1. 1 Nuvem de palavras utilizando 727 artigos da busca de dados da Web of Science e PubMed usando as palavras-chave "mass spectrometry" AND biofluid* AND disease. ........................................................................................................... 22 Figura1. 2. Ilustração da contribuição científica por países, demonstrada a partir da intensidade de cor, com a temática “biofluidos”, “MS” e “doenças”. ......................... 23 Figura1. 3. Diagrama de fluxo de trabalho para diagnósticos de doenças, detectando biomarcadores em biofluidos por MS. ...................................................................... 24 Figura1. 4. Diagrama esquemático de um espectrômetro de massas. .................... 43 Figura1. 5. Esquema do processo MALDI. .............................................................. 45 Figura1. 6. Processo de ionização da fonte Eletrospray. ......................................... 46 Figura1. 7. Gráfico de scores e loads do modelo PCA de espectros MALDI(+) FT- ICR de amostras de saliva positivas ou negativas para SARS-CoV-2. ..................... 52 Figura2. 1 Espectros de massas MALDI(+) de amostras de saliva com e sem preparo de amostra: A) antes e B) após digestão tríptica e processamento em coluna spin C18. .................................................................................................................. 95 Figura2. 2 Espectros de massas MALDI(+) da amostra de saliva e A) Sem digestão tríptica, (B- E) Após digestão tríptica: B)10 μL tripsina e 2 h digestão tríptica, C)10μL tripsina e 16h digestão tríptica, D) 5 μL tripsina e 2 h digestão tríptica, e E) 5 μL tripsina e 16 h digestão tríptica ................................................................................ 97 Figura2. 3 Gráfico de scores e loadings da PCA do conjunto de dados dos espectros de massas MALDI(+) de amostras de saliva positivas e negativas para SARS-CoV-2. ............................................................................................................................... 101 Figura2. 4 Sinal característico nos espectros MALDI(+) individuais entre amostras positivas para SARS-CoV-2 (verde) versus amostras negativas (cinza). ............... 104 Figura3. 1. Espectros de ESI(±)-Orbitrap MS de extratos lipídicos do conjunto de amostras de soro humano após preparo de amostra para purificação de lipídios contendo (A) 239 amostras para ESI(+) e (B) 232 para ESI(-). .............................. 122 Figura3. 2. Gráficos biplot de PCA dos dados de ESI(±)-Orbitrap MS de extratos lipídicos de amostras de soro positivas ou negativas para SARS-CoV-2: (A) ESI(+) e (B) ESI; e gráficos de scores das componentes da PLS-DA .................................. 124 Figura3. 3. Parâmetros de validação cruzada para o modelo PLS-DA. R2, e Q2 representam as estimativas pela validação cruzada. A-B) ESI(+)-Orbitrap MS. C-D) ESI(-)-Orbitrap MS. ................................................................................................ 125 Figura3. 4. Sinais m/z discriminantes identificadas de acordo com a pontuação de Importância Variável na Projeção (VIP) (A) para dados de ESI(-) e (B) ESI(+)- Orbitrap MS............................................................................................................ 126 Figura3. 5.Classes lipídicas detectadas entre os 100 principais sinais VIP para dados de (A) ESI(+) MS, (B) ESI(-) MS e (C) ESI(±) MS. Estes são relevantes para distinguir entre classes positivas e negativas para a COVID-19. ............................ 129 Figura3. 6. Espectros de MALDI(+)-TOF MS de amostra de soro humano (A) sem matriz (B); contendo matriz CHCA à 1 mg/mL (C) e à 10mg/mL. ........................... 133 Figura3. 7. 900 espectros de massas MALDI(+)-TOF MS de 300 amostras de soro humano após preparo de amostra utilizando Spin Column C18, sendo que 450 correspondem ao soro positivo pra COVID-19 (vermelho) e 450 ao soro negativo para COVID-19 (azul). ........................................................................................... 134 Figura3. 8. Análise estatística dados MALDI(+)-TOF MS. (A) Volcano plot indicando os sinais presentes no conjunto de amostras, com diferença estatística de acordo com as contagens do espectro, cada mancha representa um sinal. No eixo y, Log2 (valor p), no eixo x, Log2 (FC), os valores negativos indicam sinais mais relevantes em amostras negativas e valores positivos mostram sinais mais relevantes em amostras positivas. (B) Gráfico de PCA de espectros MALDI(+)-TOF MS de amostras de soro positivas e negativas para SARS-CoV-2. (C) Heatmap de espécies moleculares diferenciais em pacientes com COVID-19 em comparação com pacientes negativos. .............................................................................................. 135 Figura3. 9. Análise estatística de dados MALDI(+)-TOF MS. (A) O gráfico de scores de PLS-DA ilustra a segregação do perfil proteômico entre pacientes positivos para COVID-19 e controles. (B) Sinais m/z discriminantes baseados em VIP scores. Os 25 principais valores m/z com VIP scores >1,4. (C-D) Parâmetros de validação cruzada para PLS-DA, incluindo resultados R2 e Q2 estimados através de validação cruzada. ................................................................................................................. 137 LISTA DE TABELAS Tabela 1. 1. Artigos publicados nos últimos 5 anos sobre diagnósticos de doenças a partir do uso de MS e amostras de sangue. ............................................................. 27 Tabela 1. 2. Artigos publicados nos últimos 5 anos para diagnósticos de doenças a partir do uso de MS e amostras de saliva. ............................................................... 38 Tabela 1.3. Comparação entre os analisadores de massas..................................... 48 Tabela 1. 4.Estudos utilizando as técnicas MALDI MS e LC-ESI MS e aprendizagem de máquina nas análises de biofluidos com SARS-CoV-2. ...................................... 57 Tabela 2. 1 Dados dos participantes ........................................................................ 91 Tabela 2. 2 Peptídeos identificados em amostras de saliva após a digestão de proteínas e SPE. ...................................................................................................... 96 Tabela 2. 3 Número de sinais detectados com S/N > 4%. ....................................... 98 Tabela 2. 4 Sequência peptídica identificada em cada tipo de protocolo de proteína de digestão tríptica. .................................................................................................. 99 Tabela 2. 5 Número de sinais detectados e tempo de aquisição dos espectros de massas do MALDI FT-ICR em função da otimização dos parâmetros. .................. 100 Tabela 2. 6 . Desempenho dos parâmetros dos modelos SVM pelos espectros MALDI com Discriminante de Fisher (FD). ............................................................. 103 Tabela3. 1 Métricas do modelo SVM ..................................................................... 120 Tabela3. 2. Desempenho de Parâmetros de Modelos SVM com dados de ESI(±)- Orbitrap MS de amostra de soro humano, após o preparo de amostra para purificação de lipídios, com Discriminante de Fisher (FD). ..................................... 127 Tabela3. 3. Desempenho de Parâmetros de Modelos SVM com espectros de massa MALDI(+)-TOF MS de amostra de soro humano após preparo e otimização das análises. ................................................................................................................. 138 LISTA DE ABREVIATURAS ACN – Acetonitrila ADA, ADA tree boosting AmBic - Bicarbonato de amônio ANN - Artificial Neural Network AO - osteoartrite primária AR - artrite reumatoide CHCA - α-cyano-4-hydroxycinnamic acid DHB - 2,5- dihydroxybenzoic acid DIA - Data Independent Acquisition DMTC - Doença mista do tecido conjuntivo DNN - deep neural network DPOC - Doença pulmonar obstrutiva crônica DT - Decision Tree DTT – Ditiotreitol ESI - Electrospray ionization ESPEC - Especificidade FC - Fold-Change FD - Discriminante de Fisher FN - Falso negativo FP - Falso positivo FT-ICR - Fourier-transform ion cyclotron resonance FWHM - Full width at Half maximum GA - Genetic Algorithm GBDT - Gradient Boosted Decision Trees GBM - Gradient Boost Machine GDB - gradient tree boosting HPLC - High-performance liquid chromatography IAA - Iodoacetamida IgG - Imunoglobulina G IgM - Imunoglobulina M IOP - Insuficiência ovariana prematura IPA- Ingenious Path Analysis IT - Ion trap KNNk - Nearest Neighbors LC - Liquid chromatography LDA - Linear Discriminant Analysis LR - Logistic Regression MALDI - Matrix assisted laser desorption ionization MCC - Coeficiente de correlação de Matthews ML - Machine learning MLP - Multilayer Perceptron MS - Mass spectrometry NB - Naïve Bayes nLVs - número ideal de variáveis latentes OMS - Organização Mundial de Saúde OPLS-DA - Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis OPS - Ordered predictor selection PC - Principal Components PCA - Principal component analysis PHS - Púrpura de Henoch-Schönlein PLS-DA - Partial least squares-discriminant analysis QC - Quick Classifier Q-TOF – Quadrupole time-of-flight RF - Random Forest ROC - Receiver Operating Characteristic RT-PCR – Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction SA - Sinapinic acid SAFP - Síndrome antifosfolípide primária SARS - Síndrome respiratória aguda grave SENS - Sensibilidade SNN - Supervised Neural Network sPLS-DA - Sparse partial least squares-discriminant analysis SVM - support-vector machine TDAH - Transtorno de déficit de atenção e hiperatividade TFA - Ácido trifluoroacético TFN - Taxa de falso negativo TFP - Taxa de falso positivo TOF - Time-of-flight TQ – triplo quadrupolo UMAP - uniform manifold approximation and projection UPLC - Ultra Performance Liquid Chromatography UHPLC - Ultra High Performance Liquid Chromatography Varsel - Variáveis selecionadas VIP- variable importance projection VN - Verdadeiro negativo VNP - Valor negativo de prevalência VP - Verdadeiro positivo VPP - Valor positivo de prevalência XGB - XGBoost XRF- extreme random forest LISTA DE SÍMBOLOS % – Porcentagem °C – grau Celsius CHCl₃ - Clorofórmio Da – Dalton EtOH – etanol G - força G h - hora Hz – Hertz kV - kilovoltz m – massa m/Δm50% – poder de resolução de massa MeOH – metanol mg/mL – miligrama por mililitro min - minutos mL – mililitro mM – miliMolar ms - milisegundo n – número de amostras nm – Nanometro ns - nanosegundos rpm – rotação por minuto S/N – sinal por ruido scans – número de aquisições espectrais acumuladas V – Voltz v/v – volume por volume z- carga γ – gama ε - margem μg/μL – micrograma por microlitro μL - microlitro μM – micromolar ns – nanosegundos RESUMO A doença COVID-19 foi e continua sendo uma preocupação na saúde mundial, a identificação de pacientes infectados em triagens rápidas e eficientes ainda são necessárias para conter a propagação. Os fluidos biológicos, como soro e saliva, oferecem facilidade de coleta e fornecem informações ricas sobre as alterações moleculares do corpo durante alguma doença. O uso da espectrometria de massas (do inglês mass spectrometry, MS) combinada com a aprendizagem de máquina (do inglês machine learning, ML) tem sido aplicado a biofluidos de pacientes portadores de doenças e controles, para a identificação de biomarcadores e realização de uma triagem rápida e eficaz. Assim, esta tese tem como objetivo apresentar os avanços na busca de biomarcadores de doenças, principalmente da COVID-19, utilizando tecnologias baseadas em ionização e dessorção a laser assistida por matriz (do inglês, matrix assisted laser desorption ionization, MALDI) MS e ionização por eletrospray (do inglês, electrospray ionization, ESI) MS e tratamentos de dados quimiométricos. Para isso, foi desenvolvida uma metodologia para triagens de pacientes com suspeita de COVID-19 a partir de amostras de saliva, utilizando MALDI MS mediante auxílio da aprendizagem por Máquina de Vetores de Suporte (do inglês, support-vector machine, SVM), otimizando o preparo de amostra e os parâmetros da análise. A maior eficiência em menor tempo de análise foi obtido com a digestão da saliva em 10 μL de tripsina por 2 h e uso de 1M de resolução. Modelos SVM foram criados com os dados das análises de 149 amostras, sendo estas 97 positivas e 52 negativas para COVID-19 por RT-PCR. Dois modelos apresentaram os melhores resultados. O SVM1 selecionou 780 variáveis e possui taxa de falso negativo (TFN) de 0%, já o SVM2 selecionou somente 2 variáveis (525,4 Da e 1410,8 Da) com TFN de 3%. Outra aplicação da MS em biofluidos foi o desenvolvimento de um método multiômico para triagem de pacientes infectados com SARS-CoV-2 com base nos perfis lipídicos e proteômicos do soro. A ESI MS foi utilizada para investigar o perfil lipídico de 239 amostras de soro (119 positivas e 120 negativas para COVID-19 pelo teste ELISA). A MALDI MS foi utilizada para analisar o perfil proteômico de 300 amostras de soro (150 positivas e 150 negativas para COVID-19 pelo teste ELISA). Após o processamento dos dados de MS e a seleção de variáveis, análises estatísticas, como Volcano plot, o Heatmap, a análise de componentes principais (do inglês, principal component analysis, PCA), a análise discriminante de mínimos quadrados parciais (do inglês, partial least squares- discriminant analysis, PLS-DA) e a SVM, foram realizadas para distinguir as variáveis mais relevantes para classificar amostras positivas e negativas para COVID-19. Nas análises lipidômicas usando ESI(±)-Orbitrap MS e modelos SVM, observou-se sensibilidades de 96,67% e 100%, especificidades de 82,14% e 96,88%, e acurácias de 89,66% e 98,44% para análises de modo de íon positivo e negativo, respectivamente. Já nas análises proteômicas usando MALDI(+)-TOF MS, o modelo linear PLS-DA demonstrou uma precisão de 99,10%. Sendo assim, a combinação das técnicas MS com tratamento de dados quimiométricos, demonstrou alternativas promissoras com alta sensibilidade e especificidade para discriminar amostras de biológicas infectadas e não infectadas pelo SARS-CoV-2. Palavras-chave: Biofluidos. Espectrometria de massas. Aprendizagem de máquina. COVID-19. . ABSTRACT The COVID-19 disease has been and continues to be a global health concern. The identification of infected patients through rapid and efficient screenings remains necessary to contain its spread. Biological fluids, such as serum and saliva, offer ease of collection and provide rich information about molecular changes in the body during illness. The use of mass spectrometry (MS) combined with machine learning (ML) has been applied to biofluids from patients with diseases and controls to identify biomarkers and conduct rapid and effective screenings. Therefore, this thesis aims to present advancements in the search for disease biomarkers, particularly for COVID- 19, using technologies based on Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI MS) and Electrospray Ionization Mass Spectrometry (ESI MS), along with chemometric data treatments. To achieve this, a methodology was developed for screening patients suspected of having COVID-19 based on saliva samples, using MALDI MS with the assistance of Support Vector Machine (SVM) learning. This involved optimizing sample preparation and analysis parameters. The most efficient results in a shorter analysis time were obtained by digesting saliva with 10 μL of trypsin for 2 hours. Optimization of the parameters at 1M resolution was ideal for the analyses. SVM models were created using data from the analysis of 149 samples, 97 positive and 52 negative for COVID-19. Two models yielded the best results. SVM1 selected 780 variables with a false negative rate (FNR) of 0%, while SVM2 selected only 2 variables (525.4 Da and 1410.8 Da) with a 3% FNR. Another application of MS in biofluids was the development of a multiomic method for screening patients infected with SARS-CoV-2 based on serum lipid and proteomic profiles. ESI MS was used to investigate the lipid profile of 239 serum samples (119 positive and 120 negative for COVID-19). MALDI MS was used to analyze the proteomic profile of 300 serum samples (150 positive and 150 negative for COVID- 19). After processing MS data and variable selection, statistical analyses such as Volcano plot, Heatmap, principal component analysis (PCA), partial least squares discriminant analysis (PLS-DA), and SVM were performed to distinguish the most relevant variables for classifying positive and negative samples for COVID-19. In lipidomic analyses using ESI(±)-Orbitrap MS and SVM models, sensitivities of 96.67% and 100%, specificities of 82.14% and 96.88%, and accuracies of 89.66% and 98.44% were observed for positive and negative ion mode analyses, respectively. In proteomic analyses using MALDI(+) MS, the linear PLS-DA model demonstrated an accuracy of 99.10%. Thus, the combination of MS techniques with chemometric data treatments has shown promising alternatives with high sensitivity and specificity to discriminate infected and non-infected biological samples by SARS- CoV-2. Keywords: Biofluids. Mass spectrometry. Machine learning. COVID-19. SUMÁRIO CAPÍTULO I – Estado da arte .................................................................................. 20 1.1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 20 1.2 BIOFLUIDOS .................................................................................................. 21 1.2.1 Sangue .................................................................................................... 25 1.2.2. Saliva ...................................................................................................... 35 1.3 ESPECTROMETRIA DE MASSAS ................................................................. 42 1.3.1 MALDI MS ................................................................................................ 44 1.3.2 ESI MS ..................................................................................................... 46 1.3.3 Analisadores de massas .......................................................................... 48 1.3.4 Processamento de dados e análise estatística ......................................... 50 1.4 COVID-19 ....................................................................................................... 53 1.4.1 COVID e MS ............................................................................................ 54 1.5 CONCLUSÃO ................................................................................................. 66 1.6 REFERÊNCIAS .............................................................................................. 67 CAPITULO II – MALDI(+) FT-ICR combinada com aprendizagem de máquina para triagem diagnóstica para COVID-19 baseada em amostras de saliva ...................... 87 2.1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 88 2.2 METODOLOGIA ........................................................................................ 90 2.2.1 Amostras e reagentes .............................................................................. 90 2.2.2 Análise por MALDI-FT-ICR MS ................................................................ 92 2.2.3 Análise de dados ...................................................................................... 92 2.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................... 94 2.4 CONCLUSÃO .......................................................................................... 106 2.5 REFERÊNCIAS ............................................................................................ 107 CAPITULO III – Triagem para diagnóstico para COVID-19 baseado em dados multiômicos por espectrometria de massas de alta resolução (MALDI(+)-TOF MS e ESI(±)-Orbitrap MS) ............................................................................................... 112 3.1 INTRODUÇÃO ............................................................................................. 113 3.2 METODOLOGIA ........................................................................................... 116 3.2.1 Amostras e reagentes ............................................................................ 116 3.2.2 Extração de lipídios ................................................................................ 116 3.2.3 Preparo das amostras para análise MALDI(+)-TOF MS ......................... 117 3.2.4 Análise por ESI(±)-Orbitrap MS .............................................................. 117 .3.2.5 Análise por MALDI(+)-TOF MS ............................................................. 118 3.2.6 Processamento de dados e análise estatística de dados ....................... 118 3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................... 121 3.4 CONCLUSÃO ............................................................................................... 141 3.5 REFERÊNCIAS ............................................................................................ 142 20 CAPÍTULO I – Estado da arte 1.1 INTRODUÇÃO A combinação de biofluidos e espectrometria de massas (do inglês, mass spectrometry, MS) surge como uma abordagem inovadora e promissora para a triagem eficaz de pacientes suspeitos de algumas doenças, incluindo a COVID-19, quando a rapidez do diagnóstico é fundamental para adoção de medidas que evitem a proliferação da doença. Diante da necessidade urgente de métodos diagnósticos rápidos e precisos, essa interseção entre a análise de biofluidos e a tecnologia de MS tem se destacado como uma ferramenta valiosa na identificação de biomarcadores associados à infecção pelo SARS-CoV-2.1 Biofluidos, como sangue e saliva, oferecem uma fonte rica de informações sobre o estado fisiológico do organismo e, consequentemente, podem conter marcadores específicos da presença de alguma doença. A MS, por sua vez, é uma técnica analítica poderosa que permite a detecção de diversas moléculas em uma só análise, com base em sua massa molecular. Ao combinar essas duas abordagens, a avaliação dos padrões dos perfis moleculares distintos de biofluidos associados à COVID-19 proporcionam uma perspectiva única para o diagnóstico precoce e preciso da doença.2 Por fornecer uma enorme quantidade de dados, a combinação da MS com a quimiometria é crucial para obtenção de resultados mais rápidos e confiáveis. Essa combinação inovadora representa um passo essencial no desenvolvimento de estratégias diagnósticas mais eficazes para combater a propagação da COVID-19, oferecendo a possibilidade de intervenções rápidas e personalizadas para melhor gerenciamento clínico e controle da doença.3 Nesta interseção entre biofluidos e MS, é possível analisar uma variedade de biomarcadores, incluindo proteínas, lipídios e seus metabólitos, que podem refletir as alterações bioquímicas induzidas pela infecção viral.4 À medida que a pesquisa avança nesse campo, a integração de tecnologias de ponta na análise de biofluidos e MS promete aprimorar ainda mais a sensibilidade e a especificidade dos métodos de triagem não só da COVID-19, mas também de diferentes doenças. 21 1.2 BIOFLUIDOS Os biofluidos, como soro, plasma, saliva, líquido cefalorraquidiano, urina e meios condicionados pela medula óssea, são originários do interior do corpo humano, sendo fontes importantes de informações sobre as condições fisiológicas dos indivíduos. Portanto, apresentam um grande número de moléculas como proteínas, lipídios, peptídeos e substâncias compostas por componentes excretados pelas células ao longo do corpo. Esses biofluidos ricos em informações químicas podem conter moléculas que, quando identificadas ou quantificadas, podem indicar a ocorrência de alterações moleculares que ocorrem no corpo em condições de doença. Essas alterações nas moléculas relacionadas à doença podem então ser usadas como biomarcadores de doenças.5 Os biomarcadores são características mensuráveis e objetivas que podem ser indicadores de processos biológicos normais, patológicos ou respostas a uma intervenção terapêutica. Podem ser usados principalmente para avaliar o estado de saúde, a presença de uma doença ou fazer previsões prognósticas. Muitas destas substâncias podem ser detectadas em estágios precoces de uma doença, quando as manifestações clínicas ainda não são tão evidentes. Dependendo do marcador, diferentes tipos de amostras biológicas podem ser utilizadas com esta finalidade.6 Alguns biofluidos estão entre as formas mais fáceis de obtenção das amostras clínicas. A coleta de saliva e urina são processos minimamente invasivos e de baixo custo, enquanto o sangue representa a espécime biológica mais utilizada na prática clínica, para realização de exame clínico de rotina.7 A necessidade de detectar biomarcadores de doenças em amostras de pacientes de forma rápida e precoce, é de extrema importância no combate a surtos e epidemias. A detecção da doença e diagnóstico de pacientes é uma ferramenta crítica para monitorar a disseminação da doença, orientar decisões terapêuticas e profiláticas e elaborar protocolos de distanciamento social, quando necessário.8 O desenvolvimento de técnicas rápidas e de resultados confiáveis, fez com que o uso da MS de rápida aquisição se tornasse uma ferramenta promissora para pesquisa e diagnósticos de doenças, devido à flexibilidade da técnica que permite a análise proteômica, metabolômica e lipidômica em uma ampla gama de matrizes biológicas, incluindo os biofluidos.4,5 22 A busca por artigos científicos utilizando as palavras chaves “(biofluid or biofluids) AND mass spectrometry AND disease”, no período de 2003 até 2023, mostra que a identificação de biomarcadores e o uso dos biofluidos como soro e plasma estão em destaque na nuvem de palavras geradas pelo Bibliometrix em pesquisa com banco de dados Web of Science e PubMed. (Figura1. 1). Figura1. 1 Nuvem de palavras utilizando 727 artigos da busca de dados da Web of Science e PubMed usando as palavras-chave "mass spectrometry" AND biofluid* AND disease. Fonte: Bibliometrix.9 Ainda, com o mesmo conjunto de dados, a Figura1. 2 aponta, ilustrado com as intensidades da cor azul, os países que mais colaboraram para a produção dos trabalhos envolvendo biofluidos, MS e doenças, nos últimos anos e as colaborações entre esses países, ilustrado por linhas vermelhas. O Brasil está em destaque entre os 20 países que mais colaboram nos estudos envolvendo essa temática. 23 Figura1. 2. Ilustração da contribuição científica por países, demonstrada a partir da intensidade de cor, com a temática “biofluidos”, “MS” e “doenças”. Fonte: Bibliometrix.9 As diversas aplicações da MS para análises de biofluidos abre um campo de oportunidades para identificações de possíveis biomarcadores de diferentes doenças. O avanço no estudo na área da proteômica, metabolômica e lipidômica auxilia no processo de diagnósticos rápidos e precoces. Na Figura1. 3 observa-se um esquema para o processo de possíveis diagnósticos utilizando biofluidos e MS. Os diferentes biofluidos, por serem amostras complexas, necessitam de um preparo antes da obtenção dos espectros, para que não haja supressão iônica dos analitos de interesse. Após a aquisição dos dados espectrais o uso de ferramentas computacionais auxilia na rapidez e eficiência do tratamento de dados.10–12 24 Figura1. 3. Diagrama de fluxo de trabalho para diagnósticos de doenças, detectando biomarcadores em biofluidos por MS. Fonte: Adaptado de Mahmud et al.10 e Dunphy et al.11 A qualidade do preparo da amostra é um fator importante para o sucesso de todo procedimento analítico. A extração dos analitos de matrizes biológicas complexas, como soro, plasma, saliva, entre outras, removerá componentes da matriz que poderão interferir na análise e, no caso de analitos de baixa abundância, o procedimento pode incluir uma etapa de pré-concentração para atingir os limites de detecção da técnica analítica aplicada e obter melhores relações sinal-ruído.13–15 Alguns dos preparos mais utilizados em análises de biofluidos por MS são: i) a extração em fase sólida, remove analitos interferentes de uma matriz líquida, muito utilizado na remoção de sais;16 ii) extração líquido-líquido, separa em diferentes fases os compostos de interesse, como na aplicação do protocolo Bligh e Dyer em estudo lipidômico;17 iii) precipitação de proteínas, usada tanto para remoção de proteínas em estudos metabolômicos, quanto para sua concentração em estudos proteômicos;18 iv) filtros de massa molar, utilizados em estudos de moléculas de massa molar mais baixa como peptídeos, aminoácidos e lipídios;19 v) digestão de proteínas, para análise do perfil proteômico;20 entre outros. O método de preparo da amostra escolhido dependerá do analito de interesse e da matriz biológica utilizada.13–15 25 1.2.1 Sangue O sangue é um tecido circulante que transporta gases (oxigênio e gás carbônico) e outras moléculas para todos os órgãos e tecidos do organismo. Caracteriza-se por apresentar uma matriz líquida (plasma), onde se encontram suspensos os elementos celulares do sangue (hemácias, leucócitos e plaquetas).21 O plasma é a parte líquida do sangue não coagulado, sem as células sanguíneas, é composto por água e várias substâncias dissolvidas. No plasma são encontrados: eletrólitos (íons sódio, potássio, cálcio, magnésio, cloreto, bicarbonato, fosfato, entre outros) que desempenham papéis cruciais na regulação do equilíbrio hídrico e na função celular, proteínas, como a albumina (que contribui para a pressão osmótica do sangue, ajudando a manter o equilíbrio de fluidos entre o sangue e os tecidos), globulinas (que incluem as imunoglobulinas (anticorpos) e outras), fibrinogênio (que desempenha um papel crucial na coagulação sanguínea), dentre outros compostos químicos. Além disso, também estão presentes no plasma: nutrientes como, glicose, aminoácidos, lipídios (que fornecem energia e auxiliam nas funções celulares); produtos do metabolismo celular, hormônios, gases sanguíneos, vitaminas, enzimas e diversas substâncias químicas necessárias para a homeostase e funcionamento adequado do corpo.21 O soro é semelhante ao plasma em sua composição, porém não possui os fatores de coagulação sanguínea. Para a obtenção do soro, coleta-se o sangue na ausência de anticoagulantes, e nessas condições, forma-se um coágulo de fibrina que é então removido, restando o soro com uma concentração de proteínas um pouco inferior à do plasma.22 Assim, mesmo com uma coleta um pouco mais invasiva comparada à coleta de saliva e urina, o soro é um fluido corporal frequentemente utilizado em rotinas de exames clínicos, por melhor refletir o estado fisiológico global de um organismo. Podendo ser uma excelente fonte para descoberta de novos biomarcadores de doenças devido ao rico repertório de biomoléculas provenientes de todo o corpo humano.11,23 Mesmo sendo um biofluido rico em informação molecular, identificar biomarcadores de doenças no proteoma sérico pode ser desafiador, apesar de apresentar uma alta concentração de proteínas, 99% do seu conteúdo proteico correspondem a proteínas do próprio sangue (albumina, transferrinas, 26 imunoglobulinas). O outro 1% geralmente é composto por proteínas de maior interesse, as proteínas secretadas pelos tecidos.11 Técnicas como a MS podem ser ferramentas promissoras na pesquisa de proteomas e, principalmente, de biomarcadores devido à sua alta seletividade, sensibilidade e versatilidade.24 No entanto, essa abundância de proteínas é um fator limitante no resultado das análises. Independente da técnica de ionização utilizada, a ionização das proteínas predominantes pode acarretar uma forte supressão de íons causada, por exemplo, pela abundância da albumina, esse fenômeno resulta em perda de informações sobre os possíveis biomarcadores, que geralmente são os objetos de interesse na pesquisa da doença.25 Portanto, fluxos de trabalho dedicados à análise de biomoléculas no soro por MS incluem algumas etapas de pré-tratamento de amostras destinadas à redução da complexidade da amostra, reduzindo ou eliminando as proteínas altamente abundantes e favorecendo os analitos de maior interesse.26 A sensibilidade da análise MS depende da natureza da amostra, consequentemente, a etapa de preparação para obter amostras purificadas, concentradas e ricas em moléculas de interesse é crucial.27 Técnicas como a extração, precipitação e filtros de corte de massa molar, têm sido aplicadas para melhorar a qualidade da análise por MS, aumentando a sensibilidade e eficiência de identificação de biomarcadores em análises de plasma e soro.15,27 A Tabela1. 1 mostra alguns dos artigos publicados nos últimos 5 anos que utilizam a MS para diferenciar amostras de sangue de indivíduos saudáveis de amostras de pacientes com diferentes tipos de doenças. 27 Tabela 1. 1. Artigos publicados nos últimos 5 anos sobre diagnósticos de doenças a partir do uso de MS e amostras de sangue. Amostra Preparo de amostra Equipamento Tratamento de dados Resultados Ano 228 amostras de plasma (55 controles, e 173 pacientes com doenças autoimunes sistêmicas Precipitação das proteínas: Adição de EtOH:MeOH e centrifugação. O sobrenadante coletado, evaporado e reconstituído com H2O (ácido fórmico 0,1%) e MeOH. HPLC-ESI-QTOF MS (Agilent Technologies) Software: R Tratamento de dados: PCA, PLS Banco de dados: METLIN, LipidMaps, KEGG, massbank, e HMDB Associação da maioria das patologias das doenças autoimunes sistêmicas investigadas com alterações metabólicas no plasma. Os metabólitos que distinguem entre controles e doenças autoimunes sistêmicas incluíam ácidos graxos insaturados, acilcarnitinas, acilglicinas e aminoácidos. 202028 25 amostras de soro (5 controles e 20 pacientes com diferentes estágios de doença pulmonar obstrutiva crônica DPOC). A extração de lipídios: Adição de clorofórmio e MeOH contendo BHT, agitação e centrifugação. As camadas inferiores foram lavadas com um solução de KCl. ESI TQ MS/MS (Biosystems) Software: Metaboanalyst Tratamento de dados: OPLS e curva ROC Um painel de 50 metabólitos lipídicos, incluindo fosfolipídios, esfingolipídios, glicerolipídios e ésteres de colesterol, pode ser usado para diferenciar a presença de DPOC. Análises multivariadas sugerem que quatro espécies lipídicas poderiam ser potenciais biomarcadores para DPOC. 202029 38 amostras de soro (10 controles e 28 pacientes com fibrose cística) Extração de proteínas: Utilização do kit de depleção de albumina e IgG de esferas. A concentração proteica de cada amostra foi determinada utilizando o kit 2D-Quant. MALDI- TOF MS/MS (Bruker Daltonics) UPLC- TQ MS/MS (Waters Corporation) Software: Metaboanalyst Tratamento de dados: PLS- DA, curva ROC Banco de dados: MASCOT. IPA Proteínas relacionadas à inflamação e reparos teciduais, como antiproteases, foram perturbadas nos soros de fibrose cística. As proteínas de transporte de vitamina A e D e as lipoproteínas foram reguladas negativamente, sugerindo possíveis explicações para as suas deficiências na fibrose cística. 202030 161 amostras de soro (64 controles, 67 pacientes com câncer da bexiga e 30 pacientes com presença de cálculos no trato urinário). Purificação das amostras: Utilização de esferas magnéticas de troca catiônica fraca (WCX- MB, Bioyong). Extração de lipídios: método MTBE, agitação, centrifugação e uso de concentrador de amostra. MALDI Clin-TOFⅡ (Bioyong), LC- Orbitrap MS/MS (Thermo Fisher Scientific) Software: BioExplorer Tratamento de dados: teste de Wilcoxon, KNN e curva ROC Banco de dados: proteoma humano (UniprotKB) Foi contruido um modelo de diagnóstico contendo cinco peptídeos. Para o câncer de bexiga em estágio inicial, a sensibilidade e a especificidade foram de 92,31% e 93,75%, respectivamente; a sensibilidade do câncer de bexiga precoce de baixo grau foi de 90,00%; e o valor da AUC foi 0,944. 202031 28 Amostra Preparo de amostra Equipamento Tratamento de dados Resultados Ano 259 amostras de soro (100 controles, 60 pacientes com comprometimento cognitivo leve e 99 com doença de Alzheimer). Separação de peptídeos e proteínas: eletroforese em gel de poliacrilamida BLOTCHIP® Extração de peptídeos: cartucho de extração em fase sólida Sep- Pak C18 e um concentrador MALDI-TOF/TOF MS (Bruker Daltonics) e LC-MS/MS (Thermo Fisher Scientific). Software: ClinProTools e R Tratamento de dados: teste de Wilcoxon, curva ROC Banco de dados: MASCOT e Swiss-Prot Foi descoberto um novo biomarcador diagnóstico com conjunto de 4 peptídeos para discriminar controle, comprometimento cognitivo leve e Alzheimer com 87% de sensibilidade e 65% de especificidade entre controle e DA. 202032 105 amostras de soro (35 controles, 35 de pacientes com artrite reumatóide (AR), 35 de pacientes com osteoartrite primária (AO)) Separação de peptídeos de baixo massa molar: Utilização de esferas de cromatografia de interação hidrofóbica com esferas magnéticas (MB-HIC C8). MALDI-TOF/TOF MS (Bruker Daltonics) Software: ClinPro Tools 3.0. Tratamento de dados: SNN, GA e QC. 113 sinais discriminaram AR de AO, 101 sinais discriminaram AR de controles e 95 sinais discriminaram OA de controles. O perfil peptidômico é valioso para diferenciar indivíduos com AR de OA e controles saudáveis. 202019 41 (16 controles e 25 pacientes com câncer colorretal) Precipitação de proteínas: Adição de MeOH:ACN. Sobrenadante coletado e filtrado. UPLC-QTOF-ESI MS (Thermo Fisher Scientific) Software: Metaboanalyst 5.0 Tratamento de dados: fold change, Vulcano plot, PCA, PLS-DA e RF e curva ROC Banco de dados: LIPID MAPS Lipidomics Gateway e HMDB Várias subclasses de lipídios, incluindo fosfatidilglicerol, ácidos graxos e ésteres de esterol, bem como ceramidas, confirmaram o “fenótipo lipogênico” específico para o desenvolvimento do câncer colorretal, ou seja, a lipogênese regulada positivamente associada à progressão tumoral. 202133 22 amostras de plasma (11controles e 11 pacientes com transtorno depressivo maior). Extração de metabólitos: Adição de MeOH agitação e centrifugação. Ao sobrenadante adição de H2O e clorofórmio, agitação e centrifugação. Fase superior filtrada e analisada. UHPLC-QTOF-ESI MS (ThermoFisher Scientific) (Bruker Daltonics) Software: DataAnalysis e Metaboanalyst Tratamento de dados: Fold Change, Volcano Plot, PCA, PLS-DA, RF e curva ROC Bases de dados: LIPID MAPS ® Lipidomics Gateway e HMDB Metabolome Humano Perfil metabolômico não direcionado em amostras de plasma de pacientes com transtorno depressivo maior antes e depois do tratamento com escitalopram e controles saudáveis. Foi encontrado níveis significativamente aumentados de fosfatidilserina (PS (16:0/16:1)) e ácido fosfatídico (PA (18:1/ 18:0)) e diminuição dos níveis de PS (18:3/20:4) após tratamento antidepressivo. 202134 57 amostras de plasma (32 controles e 43 indivíduos com insuficiência ovariana Extração de metabólitos e lipídios: Adição de clorofórmio:MeOH:H2O, agitação LC-QTOF ESI MS (Agilent Zorbax) Software: XCMS e Isotopologue Parameter Optimization Banco de dados: HMDB Dois grupos foram separados com sucesso através da PCA. Entre os ´picos, fenil alanina, decanoil-L- carnitina, 1-palmitoil lisofosfatidilcolina e PC (O- 16:0/2:0) foram identificados como biomarcador 202135 29 Amostra Preparo de amostra Equipamento Tratamento de dados Resultados Ano prematura) e centrifugação. Na fase superior (metabólitos) e na fase inferior (lipídios). plasmático para insuficiência ovariana prematura e monitoramento dos pacientes em período de tratamento. 146 amostras de soro (146 COVID-19 e 152 controles (73 com sintomas clínicos semelhantes, 33 pacientes com tuberculose e 46 controles saudáveis)). Diluição em tampão (kit PMFpre, Bioyong). MALDI-TOF MS (Bioyong Technologies) Software: Metaboanalyst 4.0 Tratamento de dados: LR, SVM, NB, DT, RF, GBDT, KNN. Um modelo de aprendizado de máquina de LR com 25 sinais de recursos alcançou precisão de 99%, com sensibilidade de 98% e especificidade de 100%, para detecção de COVID-19. 202136 173 amostras de soro (76 controles e 97 pacientes com artrite reumatóide (AR)) Extração de proteínas e pequenos peptídeos: Utilização de esferas magnéticas de troca catiônica. MALDI-TOF MS (PBS IIc; Ciphergen Biosystems). Software: Ciphergen ProteinChip e SPSS. Tratamento de dados: teste t de Student e o teste U de Mann-Whitney Série de modelos diagnósticos envolvendo AR e AR com complicações. Além disso, a proteína C-C motif chemokine 24 (CCL24) pode ser um valioso indicador auxiliar de diagnóstico para AR. 202137 69 amostras de soro (32 controles e 37 pacientes cirróticos com carcinoma hepatocelular) Precipitação de proteínas: Adição de MeOH, agitação e centrifugação. O sobrenadante foi coletado e filtrado e analizado. UHPLC-QTOF-ESI MS (ThermoFisher Scientific) (Bruker Daltonics) Software: Metaboanalyst Tratamento de dados: PCA, PLS-DA, ANOVA, curvaROC Banco de dados: Lipid Maps, HMDB e PubChem. 1,25-dihidroxicolesterol, palmitato de miristila, 25- hidroxivitamina D2, ácido 12-cetodesoxicólico, lysoPC (21:4) e lysoPE (22:2) representam biomarcadores notáveis que diferenciam a cirrose do carcinoma hepatocelular precoce. 202238 86 amostras de plasma (30 controles e 26 com síndrome metabólica (SM) pré-diabéticos sem tratamento e 30 pacientes com SM normoglicêmica). Extração de metabólitos: adição de MeOH, agitação e centrifugação. As amostras ressuspensas com de ácido fórmico a 0,1% em H2O e filtradas. UHPLC-QTOF MS (Bruker Daltonik). Software MetaboScape e Metaboanalyst Tratamento de dados: sPLS- DA, ANOVA Banco de dados: HMBD A análise ANOVA unidirecional revelou que 59 metabólitos diferiram significativamente entre os três grupos. Glutamina, 5-hidroxi-L-triptofano, L-sorbose e hipurato foram altamente associados à SM. No entanto, o ácido 9-metilúrico, a esfinganina e o ácido treônico foram altamente associados ao pré-diabetes/SM. 202239 129 amostras soro (51 controles e 78 pacientes com diferentes estágios de carcinoma de células renais) Precipitação de proteínas: Adição de MeOH e H2O resfriado. Incubação e centrifugação. O sobrenadante foi misturado com MeOH e de ácido fórmico 0,1%. ESI-QTOF MS (Bruker Daltonics) Software: DataAnalysis, Metaboanalyst Tratamento de dados: OPLS-DA Banco de dados: HMDB e METLIN. A maioria dos metabólitos detectados foi regulada negativamente em pacientes com câncer. Uma alteração do nível de metabólitos plasmáticos exibiu uma correlação com a progressão do tumor. 202240 30 Amostra Preparo de amostra Equipamento Tratamento de dados Resultados Ano 48 amostras de plasma (15 controles, 20 pacientes com mieloma múltiplo e 13 pacientes com leucemia de células plasmáticas) Remover detritos celulares: centrifugação. Extração de proteínas indesejáveis: Mistura com ACN:H2O, sonicação e centrifugação. O Sobrenadante foi analisado. MALDI-TOF MS (Shimadzu) Software: R pacote MALDIquant, MALDIrppa Tratamento de dados: PCA, PLS-DA, RF, DT e ANN O protocolo de extração em duas etapas melhorou a análise de amostras de plasma de sangue periférico de gamopatia monoclonal por MS e forneceu uma ferramenta para abordar a complexa etiologia molecular das gamopatias monoclonais. 202341 222 amostras de soro (83 controles e 139 pacientes com diferentes estágios de câncer cervical) Purificação com coluna Ziptip C18 (Millipore, Burlington, MA, EUA). MALDI-TOF/TOF MS (Bruker Daltonics) Software: FlexAnalysis, ClinProTools Tratamento de dados: PCA, GA, ANOVA e SNN A PCA mostrou que todos os grupos foram distribuídos separadamente, padrões de peptidoma sérico podem servir como ferramentas diagnósticas para o diagnóstico de câncer cervical em diferentes estágios. 202342 25 amostras de plasma (10 obesos (Ob), 8 pacientes com obesidade e diabetes (OD) e 7 pacientes obesos e diabéticos em tratamento com metformina) Extração de Proteínas: uso de coluna Pierce TM Top 12. A concentração proteica determinada utilizando o kit 2D- Quant. MALDI- TOF MS/MS (Bruker Daltonics) Software: BioTools e Progenesis Same Spots Tratamento de dados: PCA IPA e ANOVA Banco de dados: Mascot e. PANTHER Possíveis biomarcadores alterados pelo tratamento com metformina em pacientes obesos com e sem diabetes mellitus tipo 2. Mudanças significativas em dezesseis proteínas plasmáticas foram observadas no grupo diabéticos em tratamento com metformina quando comparado aos grupos Ob e OD 202343 20 amostras de soro (10 controles e 10 crianças com diagnóstico de TDAH). Remoção de múltiplas afinidades HSA / IgG: Utilização do cartucho giratório e coluna com resina de agarose Proteína A colocadas em uma coluna vazia do Bio-Spin ®. Utilização de concentradores centrífugos MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics) Software: flexAnalysis Excel e GlycoWorkbench Nas amostras de pacientes com TDAH, foi observado um aumento da fucosilação antenal, diminuição dos N-glicanos di- / triantenários com bissecção da N-acetilglucosamina (GlcNAc) e diminuição da sialilação de α2-3. 202344 60 amostras de soro (22 controles e 38 pacientes com púrpura de Henoch-Schönlein Extração de proteínas e pequenos peptídeos: Utilização de esferas MB-WCX com um separador magnético, MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics) nano UPLC –ESI Software: ClinProTools, SPSS e GraphPad Prism. Tratamento de dados: Testes t, ANOVA Identificação de potenciais biomarcadores peptídicos séricos para PHS em crianças chinesas Han; cinco proteínas foram identificadas como potenciais biomarcadores séricos. 202345 31 Amostra Preparo de amostra Equipamento Tratamento de dados Resultados Ano e pós-terapia) MS/MS (Waters Corporation) (Thermo Fisher Scientific) unidirecional, testes U de Mann-Whitney e testes H de Kruskal-Wallis e curva ROC. Banco de dados: UniProt 144 amostras de soro (48 controles, 48 pacientes com câncer de fígado e 48 pacientes com hepatite B crônica) Adição de (MeOH/diclorometano). Adição de padrão: TG 51:0 e centrigugação MALDI-TOF/TOF MS (AB Sciex) com matriz de material de carbono grafitado Software: mzMine, Origin e SIMCA, Metaboanalyst, Python Tratamento de dados: ANOVA, curva ROC, PLS- DA, LDA, LR, SVM, MLP, RF Para a classificação de controles, câncer de fígado e hepatite B crônica, a LDA superou outras quatro técnicas de aprendizado de máquina com precisão, sensibilidade e especificidade de 92,3%, 92,3% e 96,2%, respectivamente. A análise ANOVA unidirecional revelou que numerosos TGs foram regulados negativamente no grupo com câncer de fígado. 202446 curva ROC (Receiver Operating Characteristic);DT (Decision Tree); ESI (Electrospray ionization); GA (Genetic Algorithm); GBDT (Gradient Boosted Decision Trees); HPLC (High-performance liquid chromatography); IPA (Ingenious Path Analysis); KNNk (Nearest Neighbors); LC (Liquid chromatography); LDA (Linear Discriminant Analysis); LR (Logistic Regression); MALDI (Matrix assisted laser desorption ionization); MLP (Multilayer Perceptron); MS (Mass spectrometry); OPLS-DA - Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis OPS (Ordered predictor selection); PCA (Principal component analysis); PLS-DA (Partial least squares-discriminant analysis); QC (Quick Classifier); Q-TOF (Quadrupole time-of-flight); RF (Random Forest); SNN (Supervised Neural Network); sPLS-DA (Sparse partial least squares-discriminant analysis); SVM (support-vector machine); TOF (Time-of-flight); TQ (triplo quadrupolo); UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography) 32 Além do preparo das amostras antes das análises, o uso de fontes de ionização capazes de identificar biomoléculas por MS, como a ionização e dessorção a laser assistida por matriz (do inglês, matrix assisted laser desorption ionization (MALDI)), abriu portas para a identificação de biomarcadores em amostras de soro, devido à fácil operação e excelente cobertura de uma ampla gama de moléculas.47 Estudos mostraram que existem diferenças no perfil espectral de amostras de soro ou plasma analisadas por MALDI MS entre controles saudáveis e pacientes com certas doenças. O uso da fonte MALDI destaca-se pela excelente cobertura de uma ampla gama de moléculas, principalmente grandes biomoléculas como peptídeos e proteínas.47 Uma das doenças muito estudada na busca por biomarcadores é o câncer. Biomarcadores específicos de câncer no soro como os autoanticorpos, que têm como alvo antígenos específicos associados a tumores, ou até mesmo os próprios antígenos específicos, têm sido utilizados como parâmetros de monitoramento clínico de rotina.48 No entanto, o diagnóstico baseado em um único biomarcador pode apresentar resultados falsos positivos e baixa especificidade devido a outros eventos imunológicos.48 Dessa forma, a busca por padrões proteômicos e peptidômicos séricos capazes de diferenciar indivíduos saudáveis de indivíduos com câncer, destacou o uso da técnica MALDI MS, que ganhou destaque apresentando resultados bastante satisfatórios nesses diagnósticos. Como no estudo de Rungkamoltip e colaboradores (2023),42 que a partir do uso da análise de componentes principais (do inglês, principal component analysis, PCA) observaram padrões peptídicos de discriminação entre o grupo saudável e todos os diferentes estágios do câncer cervical.42 Outro estudo que avaliou a discriminação do perfil espectral sérico, nesse caso perfil proteômico, foi realizado por Park et al. (2019)49 que relataram uma diferença estatisticamente significativa no perfil de proteínas séricas totais baseadas em MALDI-TOF MS (do inglês, time-of-flight, TOF) entre pacientes com câncer de fígado e controles saudáveis pela análise discriminante de mínimos quadrados parciais (do inglês, partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA).49 Outros tipos de câncer, como câncer de pulmão,50 bexiga,31 e ovário,51 também já foram estudados, a fim de desenvolver ferramentas diagnósticas a partir da análise por MALDI MS do perfil sérico. 33 Além do câncer, o uso da técnica MALDI-TOF MS para identificar novos biomarcadores de proteínas séricas relacionados a outras doenças como artrite reumatoide,19 mostrou-se eficaz. No estudo de Abdelati e colaboradores (2020),19 onde foram detectados 113 sinais que discriminavam pacientes com artrite reumatoide de pacientes com osteoartrite primária, outra doença que afeta as articulações, 101 sinais que discriminavam artrite reumatoide de pacientes controle e 95 sinais que discriminavam osteoartrite primária de pacientes controle.19 Assim, diagnósticos avaliando o perfil sérico por MALDI MS em diferentes tipos de doenças, como Alzheimer,32 transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (TDAH),44 fibrose cística,30 a doença autoimune púrpura de Henoch-Schönlein,45 vêm mostrando excelentes resultados nos últimos anos. Além das proteínas, o plasma e o soro abrigam uma variedade de outras moléculas, que circulam pelo corpo interagindo com tecidos e células, como metabólitos e lipídios. Os lipídios são uma classe de moléculas orgânicas que desempenham várias funções essenciais nos seres vivos. Devido às suas importantes funções fisiológicas, os lipídios estão intimamente envolvidos em distúrbios orgânicos, incluindo síndrome metabólica, inflamação, distúrbios neurológicos e cânceres.12 O acoplamento da cromatografia a MS oferece uma excelente solução para análises de misturas complexas, como biofluidos, e é uma das técnicas mais utilizada em metabolômica e lipidômica. O preparo de amostras para análise lipidômica e metabolômica é similar, normalmente são utilizadas formas de precipitação de proteínas e extração de metabólitos ou lipídios.13,52 Taşcı e colaboradores (2020)35 realizaram análises de metabólitos e lipídios não direcionados por LC-ESI-Q-TOF MS (do inglês, liquid chromatography electrospray ionization quadrupole time-of-flight) para identificar potenciais biomarcadores em amostras de plasma de insuficiência ovariana prematura. Nesse estudo, 83 picos metabólicos e 213 picos lipídicos foram encontrados semi- quantitativamente e são estatisticamente diferentes entre as amostras de pacientes com insuficiência ovariana prematura e os indivíduos controle. Os dois grupos foram separados com sucesso através da PCA e os compostos, fenil alanina, decanoil-L- carnitina, 1-palmitoil lisofosfatidilcolina e PC (O-16:0/2:0) foram identificados e propostos como biomarcador plasmático para insuficiência ovariana prematura e para monitoramento dos pacientes em período de tratamento.35 34 Em outro estudo, agora avaliando o perfil metabólico lipídico sérico de amostras de pacientes com doenças autoimunes sistêmicas, entre elas o lúpus eritematoso sistêmico, a esclerose sistêmica ou esclerodermia, a síndrome de Sjögren, a artrite reumatoide, a síndrome antifosfolípide primária, a doença mista do tecido conjuntivo e a doença indiferenciada do tecido conjuntivo. Fernández-Ochoa et al (2020),28 relataram que os modelos PLS aplicados no tratamento de dados das análises por HPLC-ESI-QTOF-MS (do inglês, high-performance liquid chromatography, HPLC) foram capazes de classificar a maioria das doenças autoimunes sistêmicas em comparação com controles saudáveis, com exceção da síndrome antifosfolípide primária e da doença mista do tecido conjuntivo. Os metabólitos de diferenciação consistiam predominantemente de ácidos graxos insaturados, acilglicinas, acilcarnitinas e aminoácidos.28 O uso da infusão direta no espectrômetro de massas, sem a separação cromatográfica, vem proporcionando análises mais rápidas e com maior reprodutibilidade de amostras biológicas para detecção de lipídios.53 Para suprir a desvantagem de possíveis interferências isobáricas (interferência que pode ser resolvida com a cromatografia) em análises de amostras complexas, o uso de analisadores de massas de alta resolução e precisão, como TOF, ressonância ciclotrônica de íons com transformada de Fourier (do inglês, fourier-transform ion cyclotron resonance, FTICR) ou Orbitrap, são um facilitador na identificação das moléculas.12,54 Na literatura é relatado que metabólitos lipídicos no sangue podem ser potenciais biomarcadores precoces de algumas doenças, como no estudo de Anand et al (2016), que detectou 23 potenciais biomarcadores lipídicos séricos de pré- eclâmpsia em gravidez entre 12 e 14 semanas, utilizando a análise por infusão direta em um espectrômetro de massas com analisador TOF (Agilent Technologies) por meio de uma fonte ESI operada no modo positivo.53 Outro estudo de lipídios séricos forneceu informações sobre biomarcadores da doença de Alzheimer, ao encontrar diferenças nos lipídios e alguns metabólitos discriminando grupo de pacientes e de controles saudáveis, utilizando uma fonte de ESI e um analisador Q- TOF em um sistema QSTAR XL Hybrid (Applied Biosystems).55 Um estudo recente (2020), também utilizou da infusão direta ESI MS para análise do perfil lipídico sérico de amostras de pacientes com diferentes estágios de doença pulmonar obstrutiva crônica e um painel de 50 metabólitos lipídicos, 35 incluindo fosfolipídios, esfingolipídios, glicerolipídios e ésteres de colesterol, pôde ser usado para diferenciar a presença de dessa doença.29 O estudo do perfil lipídico de forma rápida, reprodutível e detalhada associado a conjuntos de dados, revela que os perfis lipídicos são influenciados por fatores fisiológicos, de estilo de vida e genéticos. Assim, a análise do perfil lipidômico MS é uma ferramenta valiosa para identificar lipídios que podem se tornar novos biomarcadores usados em aplicações clínicas, como em triagens de doenças cardíacas coronárias.56 A técnica analítica MS pode auxiliar nos diagnósticos de diferentes doenças, a partir da análise do perfil proteômico, metabolômico e lipidômico sérico de indivíduos controles e pacientes com a doença. E apesar do sangue ser o biofluido mais utilizado e rico em diversas biomoléculas, outros biofluidos também podem ser interessantes matrizes na busca de diagnósticos de doenças. 1.2.2. Saliva A saliva é uma secreção complexa produzida pelas glândulas salivares (parótida, submandibular e sublingual), juntamente com outras células secretoras situadas na cavidade bucal (lábios, língua, véu palatino, etc).57 Aproximadamente 99% da saliva é água e o outro 1% é composto pelas moléculas orgânicas e inorgânicas.58 Fisiologicamente, entre as funções da saliva estão a lubrificação de todos os componentes da cavidade oral, facilitando a fonação, a percepção do sabor dos alimentos (paladar), a ação bactericida, conferida pela enzima lisozima, e a digestão do amido através da ação da amilase salivar, além do tamponamento de variações do pH bucal.57,59 Essas funções e propriedades são atribuídas à presença de algumas substâncias como: os eletrólitos, responsáveis pelo equilíbrio iônico na boca; as enzimas, como amilase-salivar e lisozima, que participam do processo de digestão; as proteínas, como as imunoglobulinas e as glicoproteínas; e lipídios.60 A saliva também contém um fluido gengival com componentes séricos, bactérias e metabólitos bacterianos, células epiteliais esfoliadas e leucócitos.61 Além disso, o fluxo e a composição química da saliva podem ser afetados pelo sexo, idade, estado 36 emocional, hidratação, exercício físico, medicação, doenças sistêmicas, abuso de substâncias e nutrição.58,62 Assim como o soro, a saliva contém diversas substâncias, e muitos desses constituintes entram na saliva a partir do sangue por difusão passiva, transporte ativo ou ultrafiltração extracelular.63 Logo, o perfil molecular da saliva também pode refletir muitas vezes um estado fisiológico ou patológico que cursam com alterações no meio interno (sangue).57 A saliva, como um biofluido de diagnóstico, oferece vantagens sobre o soro por ter uma amostragem fácil, não invasiva e indolor.62 No entanto, deve-se tomar cuidado ao substituir sangue por saliva, pois as relações entre esses biofluidos diferem dependendo da doença e do biomarcador.64 O sangue continua sendo o melhor fluido corporal para avaliação de muitos biomarcadores e sua substituição deve ser usada com cautela.64 Até agora, a saliva tem sido utilizada com sucesso para o diagnóstico de algumas doenças, com base na determinação qualitativa e/ou quantitativa de biomarcadores.65 As patologias previstas foram: doenças bucais,66,67 cardíacas,68 diabetes,69,70 síndrome de Sjörgen,71 fibrose cística72 e HIV.73,74 Algumas metodologias para confirmação dessas doenças utilizam técnicas caras, demoradas e específicas, com a identificação de somente um biomarcador. O uso da MS nas análises dos biofluidos, como a saliva, para diagnósticos de doenças, abrange a identificação de uma grande quantidade de compostos, possíveis biomarcadores, em uma única análise e tem sido cada vez mais explorado por pesquisadores nos últimos anos.75 O maior foco dessa busca em saliva é por proteínas e, quando analisadas por MS, podem ser identificadas por métodos de ionização que minimizam a fragmentação da amostra, como ionização por ESI e MALDI.76 Até o momento, o uso da técnica MALDI MS para auxiliar em diagnósticos de doenças vem se destacando com estudos que buscam moléculas ou perfis espectrais que possam diferenciar pacientes saudáveis de doentes, de maneira rápida e não invasiva.77 Entretanto, outro problema associado ao uso da saliva é a sua composição variável e heterogênea. A concentração de biomarcadores pode ser várias ordens de grandeza menor do que no soro, as variações diurnas na composição podem causar problemas na interpretação dos resultados e sua composição complexa pode causar problemas no preparo das amostras.65 37 Devido à variação na composição da saliva, dependendo da hora do dia, da hidratação, da posição corporal, da ingestão de medicamentos, da alimentação, entre outros, protocolos bem definidos devem ser realizados desde a coleta das amostras de saliva que pode ser por estimulação ou simplesmente em repouso.78 O estudo de Zhu et al (2020)79 investigou as variações do peptidoma salivar por MALDI-TOF MS, em resposta a diferentes condições de estimulação, saliva não estimulada e três tipos de amostras de saliva estimulada (saliva estimulada pelo olfato, pela gustação e pela mastigação). Por comparações do peptidoma salivar, os três tipos de saliva estimulada exibiram peptidoma significativamente diferentes. A saliva estimulada coletada em resposta à estimulação olfatória apresentou menores variações em comparação à estimulação gustativa/mastigatória. Sendo assim, sugere-se que apenas um tipo de método estimulante seja usado ao longo de uma pesquisa de peptidoma.79 Embora existam algumas desvantagens em relação ao soro, a saliva tem sido estudada extensivamente como uma ferramenta de diagnóstico em potencial na última década devido à sua facilidade de coleta, juntamente com sua diversidade de biomarcadores, como material genético e proteínas.63 A Tabela1. 2 mostra alguns dos artigos publicados nos últimos 5 anos utilizando a MS para diagnósticos de doenças, tendo como a amostra saliva de indivíduos controle e pacientes com diferentes doenças. 38 Tabela 1. 2. Artigos publicados nos últimos 5 anos para diagnósticos de doenças a partir do uso de MS e amostras de saliva. Amostra Preparo de amostra Equipamento Tratamento de dados Resultados Ano 50 amostras de saliva (16 controles, 17 pacientes com periodontite crônica e 17 com gengivite) Preparo: não utilizar quaisquer práticas de higiene bucal, coleta das 8h às 9h Remoção de materiais insolúveis: centrifugação e adição de um inibidor de proteinase. Purificação: esferas magnética de troca catiônica MALDI-TOF MS (Bioyong Tech). nanoLC-ESI MS/MS (Thermo Fisher Scientific), Software: BioExplorer e SPSS Statistics Tratamento de dados: testes t de Student ou o teste de Wilcoxon, Heatmap e curva ROC Base de dados: Mascot A maioria dos peptídeos expressos diferencialmente exibiram um aumento em participantes com periodontite crônica e gengivite em comparação com controles saudáveis. 201980 141 pacientes (74 controles e 67 pacientes com periodontites), Preparo: Não comer, beber ou escovar os dentes uma hora antes da coleta da amostra. MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics) Software: BioTyper RTCTM programa R, com biblioteca MALDIQuant. Tratamento de dados: Análise Discriminante Binária Foram detectados 217 picos na saliva, 114 foram significativamente diferentes entre os 2 grupos. Entre os principais picos de classificação, 8 apresentaram níveis mais elevados no grupo de periodontite, e 2 apresentaram níveis mais elevados no grupo controle. 202081 45 amostras de saliva (15 controles, 15 pacientes com periodontite grave e 15 após tratamento periodontal ativo) Precipitação de proteínas: Adição de acetona glacial: metanol: fosfato de tributil e centrifugação. Digestão de proteínas com tripsina. MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics) Software: SPSS Tratamento de dados: ANOVA, teste de Friedman, teste de Tukey, teste de Dunn. Banco de dados: NCBI e Mascot Um número maior de proteínas foi identificado no proteoma da saliva total de indivíduos saudáveis e tratada em comparação com o grupo com periodontite grave. A cistatina SN (CST1), correlacionou-se negativamente com a porcentagem de sítios patológicos e foi 202382 39 Amostra Preparo de amostra Equipamento Tratamento de dados Resultados Ano eficaz na discriminação da periodontite ativa do estado periodontal saudável (seja saudável ou tratada). 35 amostras de saliva (17 controles e 18 de pacientes com disfunções da articulação temporomandibular (DTM)) Preparo: saliva total não estimulada. Não realizar qualquer higiene bucal, comer ou beber por pelo menos uma hora antes da coleta. Centrifugação e filtração. MALDI-TOF/TOF MS (Bruker Daltonic) Software: ClinProTools Tratamento de dados: teste tde Student ou de um teste de Wilcoxon curva ROC, QC, GA e SNN. Banco de dados: Bruker MALDI Biotyper System Dos 23 picos que exibiram o maior poder discriminatório, foi selecionado um painel de marcadores salivares que previram os pacientes com DTM. Houve a diferenciação entre amostras salivares de indivíduos com DTM e indivíduos saudáveis, confirmando a utilidade do perfil proteômico no monitoramento da doença. 202083 65 amostras de saliva (35 controles e 30 pacientes com doença renal crônica (DRC)) Preparo: Enxague da boca com água limpa após o café da manhã, e coleta após 10 minutos. Centrifugação e adição do inibidor de protease. Esferas magnéticas foram usadas para fracionar amostras de saliva. MALDI-TOF MS nano-UPLC/ESI MS/MS (Waters) (Thermo Fisher Scientific) Software: Bio Explorer (Bioyong Tech), Tratamento de dados: KNN, curva ROC Banco de dados: Mascot Espera-se que Histatina-1, Mucina-7 e aPRP 1/2 sejam candidatos a biomarcadores salivares de pacientes com DRC em HD. Assim, a saliva pode ser um biofluido diagnóstico não invasivo promissor. 201984 53 amostras de saliva (30 controles e 23 pacientes com deficiências de anticorpos (DAP)) Preparo: Sem comer nem beber pelo menos 2 horas antes da coleta, realizada entre 10h e 12h. Adição de TFA 0.2% e HPLC-ESI MS/MS, (ThermoFisher Scientific) Software: MS-Product, GraphPad Prism Tratamento de dados: teste de Mann-Whitney e teste t, ANOVA. Os pacientes exibiram menor abundância de α-defensinas 1-4, cistatinas S1 e S2, e maior abundância de cistatina B glutationilada e cistatina SN do que os controles. Os pacientes poderiam ser 202085 40 Amostra Preparo de amostra Equipamento Tratamento de dados Resultados Ano centrifugação. Banco de dados humanos UniProt-KB agrupados em dois grupos com base em diferentes níveis de cistatina SN, S1 e S2, sugerindo que estas proteínas podem desempenhar papéis diferentes na doença. 40 amostras de saliva (20 controles e 20 pacientes com diagnóstico de diabetes mellitus tipo 2) Remoção de resíduos insolúveis. Centrifugação. Precipitação de proteínas: Mistura com ACN:H2O, agitação e centrifugação. novo chip NIMS, FEP@SiNWs MALDI-TOF/TOF e UPLC-MS/MS (Bruker Daltonics) Software: FlexAnalysis, ClinproTool e MATLAB Tratamento de dados: PCA e OPLS-DA Banco de Dados: HMBD Com o auxílio da análise multivariada, foram encontrados e identificados 22 candidatos metabólicos que podem discriminar diabetes mellitus tipo 2 e voluntários saudáveis. 202186 Amostras de saliva divididas em três grupos:1) Forma leve, 2) Moderada, 3) Grave para COVID-19. Preparo: Uso do dispositivo de algodão – Salivette™. Não beber, comer ou escovar os dentes 2 horas antes da coleta da amostra. Coletadas das 7h às 11h. MALDI-TOF Autoflex (Bruker Daltonics) Software: R com pacotes MALDiquantForeign e MALDIquant Tratamento de dados: GBM, SVM, NNET, NB e RF. Classificação entre condições leves/moderadas e graves. apresentou resultados de precisão, sensibilidade e especificidade de 67,18%, 52,17% e 75,60%, respectivamente. 202187 156 amostras de saliva (51 controles e 105 pacientes positivos para COVID-19 (coletadas no dia da inclusão do paciente Preparo: Realização de bochechos antes da coleta de saliva com Neutral Salivette® e centrifugação. MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics) Software: Flex Control e R com pacotes MALDIquant e MALDIrppa Tratamento de dados: PCA, SVM, RF e KNN e 9 picos distinguiram significativamente os dois grupos. A aplicação do modelo SVM em conjuntos de dados independentes confirmou seu desempenho com 88,9% e 80,8% de classificação correta para amostras coletadas em D0 e D30, 202288 41 Amostra Preparo de amostra Equipamento Tratamento de dados Resultados Ano (D0) e dez (D10) e trinta (D30) dias depois)) LDA. respectivamente. Por outro lado, no D10, a proporção de classificação correta caiu para 64,3%. 149 amostras de saliva (97 com RT-PCR positivo para SARS- CoV-2 e 52 negativas) Preparo: Digestão com tripsina e purificação com spin C18. MALDI MS FT-ICR MS (Bruker Daltonics) Software: DataAnalysis e MATLAB 9.0 Tratamento de dados: PCA e SVM Na otimização do método, o melhor preparo da amostra foi obtido com a digestão da saliva em 10 μL de tripsina por 2 h. Os modelos SVM1 e SVM2 apresentaram os melhores resultados. O SVM1 selecionou 780 variáveis e possui taxa de falso negativo (FNR) de 0%, enquanto o SVM2 selecionou apenas duas variáveis com FNR de 3%. 202289 curva ROC (Receiver Operating Characteristic); ESI (Electrospray ionization); GA (Genetic Algorithm); GBM (Gradient Boost Machine); HPLC (High- performance liquid chromatography); KNNk (Nearest Neighbors); LC (Liquid chromatography); LDA (Linear Discriminant Analysis); MALDI (Matrix assisted laser desorption ionization); MS (Mass spectrometry); NB (Naïve Bayes); NNET (Neural Networks); OPLS-DA - Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis; PCA (Principal component analysis); OPLS-DA (orthogonal Partial least squares-discriminant analysis); QC (Quick Classifier); RF (Random Forest); SNN (Supervised Neural Network); SVM (support-vector machine); TOF (Time-of-flight); UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography) 42 Devido à sua conexão anatômica direta com a cavidade oral, o aparelho digestório e o sistema endócrino, o uso clínico de testes de saliva para doenças relacionadas a esses campos, vem ganhando destaque.78 Como em estudos analisando amostras de pacientes com periodontites, uma condição inflamatória crônica que afeta os tecidos de suporte dos dentes, conhecidos como tecidos periodontais, por MS em amostras de saliva, que já revelaram resultados satisfatórios na busca por alterações na saliva correlacionadas a doença periodontite.90 Antezack e colaboradores (2020)81 desenvolveram, pela primeira vez em 2020, testes diagnósticos baseados em perfis proteicos de saliva, entre pacientes com periodontite e indivíduos saudáveis, detectando 114 sinais significativamente diferentes entre os dois grupos com sensibilidade igual a 70,3% e especificidade igual a 77,8% com análises utilizando MALDI-TOF MS.81 Outra doença em destaque no uso de amostras de saliva e técnicas utilizando MS nesses últimos anos foi a COVID-19. Por ser uma doença causada por um vírus respiratório a busca por uma diferença espectral salivar é de grande valia.87–89 Entretanto, anteriormente, diferentes estudos também já detectaram proteínas salivares por MS em uma variedade de doenças, sem necessariamente terem correlações com a saliva, como câncer de ovário,91 doença autoimune sistêmica, como a síndrome de Sjögren92 e diabetes93. O desenvolvimento de métodos para a identificação de biomarcadores por MS em amostras biológicas nos últimos tempos tem desempenhado papéis cada vez mais importantes na avaliação de risco de doenças, triagem, prognóstico e monitoramento de propagação, melhorando assim a saúde humana.4 1.3 ESPECTROMETRIA DE MASSAS Avanços nas descobertas de biomarcadores de doenças baseados em MS estão continuamente expandindo o panorama do diagnóstico clínico.4 A MS é uma técnica que se destaca na química analítica, por fornecer informações qualitativas para uma ampla classe de compostos. Nessa técnica, amplamente utilizada para a identificação de diversos compostos, as moléculas são convertidas em íons em fase gasosa, subsequentemente, separados no espectrômetro de massas de acordo com sua razão massa (m) sobre carga (z), m/z. 43 Além disso, a partir dos experimentos de fragmentação de íons, é possível inferir a respeito da estrutura molecular do analito.94 O funcionamento dos espectrômetros de massas constitui-se basicamente de cinco etapas: i) sistema de introdução de amostra podendo exigir ou não o preparo de amostra; ii) fonte de ionização (ionização das moléculas de interesse, analito); iii) analisador de massas (separação dos íons formados de acordo com a razão m/z); iv) detector, que realiza a “contagem” dos íons e transforma o sinal em corrente elétrica; v) processador que, posteriormente, converte a magnitude do sinal elétrico em razão m/z, ocorrendo a aquisição de um espectro de massas correspondente.95 O processo descrito é ilustrado na Figura1. 4. Figura1. 4. Diagrama esquemático de um espectrômetro de massas. Fonte: Adaptado de Romão.96 Destacam-se como componentes mais importantes no espectrômetro de massas a fonte de ionização e o analisador. Cada método de ionização produz maior abundância de tipos específicos de compostos, as diferentes formas de ionização e os analisadores de massas determinam a aplicabilidade da MS.95 No final da década de 1980, a introdução de novos métodos de dessorção- ionização, como ESI e MALDI, por John Fenn e Koichi Tanaka, revolucionou a MS de matrizes biológicas.97 A descrição do genoma, a exploração do proteoma, bem como a identificação do metaboloma, metabólitos biossintetizados por um organismo, favoreceram a busca por possíveis biomarcadores de doenças como proteínas e metabólitos.97 A ionização branda intrínseca dessas duas técnicas 44 permite a análise de moléculas intactas, proporcionando a geração de informações sobre as massas moleculares intactas com maior precisão.98 1.3.1 MALDI MS Alguns tipos de ionização são altamente energéticos e podem causar a fragmentação das ligações químicas, já em outros métodos a energia utilizada é suficiente apenas para produzir os íons e não causar a fragmentação, como as fontes ESI e MALDI, que são técnicas de ionização suave.99,100 No procedimento de ionização utilizando a técnica MALDI MS, a amostra é misturada por uma matriz e esse conjunto aplicado a uma placa metálica. A matriz consiste em substâncias, geralmente, compostos orgânicos aromáticos de baixa massa molecular, que absorvem energia no comprimento de onda do laser incidente, para a extração de moléculas de interesse e auxílio na dessorção e ionização destas.101 Cristais da matriz junto com o analito são formados durante a secagem sobre a placa. Na análise desse conjunto, a amostra e matriz depositada na placa metálica, é irradiado um laser pulsado (de 337 ou 355 nm), a matriz absorve a energia emitida e transfere-a para os compostos da amostra, ao mesmo tempo desencadeia-se um processo de dessorção, o que viabiliza a passagem da amostra do estado sólido para o gasoso, induzindo a dessorção e ionização desses cristais ricos em analitos. Após a ionização, os íons de analitos, em fase gasosa, são direcionados para o analisador de massas, que os organiza de acordo com o valor de m/z.102,103 Um esquema da ionização na fonte MALDI é mostrado na Figura1. 5. 45 Figura1. 5. Esquema do processo MALDI. Fonte: Adaptado de Hoffmann e Vincent.99 Uma das vantagens da técnica MALDI está na facilidade do preparo das amostras, ampla faixa de m/z e na habilidade de produzir íons com pouca ou nenhuma fragmentação, obtendo a massa exata de uma molécula durante a análise de MS.104 A eficiência de dessorção e ionização de diferentes tipos de moléculas depende da escolha do composto usado como matriz. O α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA), por exemplo, é uma matriz muito utilizada para identificação de peptídeos, o Sinapinic acid (SA) para proteínas intactas e o 2,5- dihydroxybenzoic acid (DHB) para glicanos.47,105 Nos últimos anos, além das aplicações da tecnologia MALDI MS para análises qualitativas e quantitativas de proteínas, essa tecnologia também tem sido amplamente utilizada em pesquisas lipidômicas e metabolômicas em amostras biológicas.106 Devido à sua ampla faixa de massa e capacidade de detectar rapidamente grandes biomoléculas em quantidades vestigiais, MALDI MS é uma ferramenta ideal para caracterizar biomarcadores de doenças em pesquisa de diagnóstico clínico.107 Alguns diagnósticos já foram realizados na identificação de infecções bacterianas e fúngicas utilizando a técnica MALDI-TOF MS, podendo superar os métodos convencionais de diagnóstico em velocidade e precisão.108 Além dos domínios do mundo microbiano, estudos demonstraram que a técnica MALDI MS também é promissora no diagnóstico rápido e precoce de câncer pulmonar,109 de ovário110 e de trato aerodigestivo.111 A técnica também se mostrou eficiente na 46 genotipagem de alto rendimento de vírus do papiloma humano oncogênico112 e na identificação genérica e rápida de vírus respiratórios cultivados, além de diversas outras aplicações já relatadas no texto anteriormente.113 1.3.2 ESI MS Ambas as fontes de ionização, ESI e MALDI, podem gerar íons [M + zH]z+. A fonte MALDI normalmente forma íons monocarregados, (z = 1), enquanto a fonte ESI tem a facilidade de formar compostos com múltipla carga (z ≫ 1). A facilidade da formação de íons multicarregados permite a detecção de moléculas com maior carga em uma faixa de m/z limitada, além de facilitar a dissociação nos experimentos de MS em tandem.114 Em uma fonte de formação de íons por Eletrospray, a solução contendo o(s) analito(s) de interesse passa por um capilar de metal, que é mantido sob um potencial elétrico (±2-±6 kV). O campo elétrico na ponta do capilar induz um acúmulo de cargas na superfície do líquido ao final do capilar, onde gotas altamente carregadas são formadas. Um cone de Taylor (estrutura líquida cônica) é criado pelo campo em um aerossol de gotículas altamente carregadas na solução na ponta do capilar. Este processo de pulverização é geralmente assistido por um fluxo de gás coaxial que evapora o solvente das gotículas carregadas. A alta densidade da gotícula carregada e as forças repulsivas entre os íons fazem com que a gota se desintegre em gotas menores, produzindo assim, íons carregados.98,100,114 Esse processo está ilustrado na Figura1.6. Figura1. 6. Processo de ionização da fonte Eletrospray. 47 Fonte: Adaptado de Hoffmann e Vincent.99 Uma das vantagens do uso dessa fonte é o acoplamento direto com a cromatografia líquida (do inglês, liquid chromatography (LC)) para a separação de misturas complexas antes da MS. A passagem da amostra por uma fase estacionária auxilia na separação e identificação dos analitos em uma amostra complexa. Com essas vantagens o LC-MS tornou-se o método padrão para análises biomédicas.100 A análise por ESI MS e experimentos MS/MS tem sido usado no diagnóstico de doenças, ganhando grande importância nos últimos anos em metabolômica e particularmente em lipidômica, nas aplicações clínicas.115 O estudo da lipidômica abre portas para interpretar as alterações no metabolismo lipídico ou na regulação das vias metabólicas lipídicas ligadas a doenças numa perspectiva fisiológica e/ou patológica.116 Por esta razão, as investigações lipidômicas geralmente se concentram na medição de alterações de lipídios em níveis de sistemas indicativos de doença, perturbações ambientais ou resposta a dieta, drogas e toxinas. Os perfis lipídicos em investigações clínicas relacionados a pessoas que estão em um estado de doença tornam-se a base para a detecção de potenciais biomarcadores relacionados à doença, quando comparados aos controles.116 Estudos apontaram a possibilidade de diagnosticar diversas doenças pelo perfil lipídico utilizando a MS, como câncer,117 doenças neurodegenerativas, como Huntington, Parkinson, Alzheimer,118 esquizofrenia e transtorno bipolar,119 doenças cardiovasculares, diabetes, obesidade e outras doenças crônicas como artrite reumatoide.119,120 A infusão direta de amostras no espectrômetro proporciona uma análise mais rápida e com maior reprodutibilidade, podendo ser uma ferramenta de triagem de alto rendimento, centenas de amostras por dia com um tempo de análise de menos de 1 minuto geralmente e o espectro de massa pode ser usado para a classificação da amostra.54 Por apresentar interferências isobáricas, a análise de amostras complexas requer o uso de instrumentos de alta resolução e precisão, ademais a elucidação estrutural pode ser feita por meio de experimentos MS/MS.12,121 Estudos já demostraram o uso da infusão direta ESI MS na caracterização lipidômica da doença de Alzheimer.122 González-Domínguez e colaboradores 48 (2014),55 identificaram alguns compostos como possíveis marcadores da doença de Alzheimer em amostras de soro utilizando ESI MS. As principais diferenças foram encontradas nos lipídios, embora alguns metabólitos de baixa massa molar também tenham mostrado alterações significativas.55 Além disso, Haijes e colaboradores (2019)123 demonstraram que o estudo da metabolômica em amostras de plasma e manchas de sangue seco por infusão direta de alta resolução espectrometria de massas é um método muito consistente, de alto rendimento e não seletivo para investigar o metaboloma em doenças genéticas.123 O conhecimento atual dos métodos de extração de lipídios, abordagens de MS, análise de dados bioestatísticos, incluindo fluxos de trabalho para a interpretação de dados lipidômicos de alto rendimento, vem se expandindo e, assim, novos mediadores lipídicos ou biomarcadores de doenças podem ser analisados por técnicas de MS apoiadas por bioinformática e bioestatística sofisticadas.12 1.3.3 Analisadores de massas Após a ionização da amostra, os íons gerados são direcionados para um analisador de massas. Os íons então são separados de acordo com a razão existente ente suas massas e cargas, ou seja, razão m/z.101 Diferentes analisadores de massa separam os íons por uma variedade de metodologias, a escolha do mais apropriado deve ser efetuada considerando a aplicação, desempenho desejado e custo.100,101 Os principais analisadores de massas são: setor magnético, quadrupolo, aprisionamento de íons (do inglês, ion trap (IT)), TOF, orbitap e FT-ICR. A principal diferença entre os analisadores são os princípios físicos utilizados em cada um para discriminar as razões m/z, o que leva a espectros de massas com magnitudes de resolução e exatidão distintos.95,100 A Tabela1.3 apresenta uma comparação entre alguns dos analisadores utilizados nos MS.99 Tabela 1.3. Comparação entre os analisadores de massas. Analisador Limite de massas (Da) Poder de Resolução (FWHM) Exatidão (ppm) Princípio de Separação Tempo de voo linear 1.000.000 5.000 200 Velocidade 49 Tempo de voo reflecton 10.000 30.000 10 Velocidade Orbitrap 6.000 1000.000 < 1 Frequência ressonância FT-ICR 4.000 10.000.000 < 1 Frequência ressonância Fonte: Adaptado de Lanças.101 Os parâmetros de desempenho mais importantes são: sensibilidade, resolução de massa e faixa de massa. O desenvolvimento dos analisadores ICR e orbitrap, que geram dados de forma diferente dos demais, requerendo o uso da transformada de Fourier para transformar os dados obtidos pelo equipamento em espectros de massas, apresentam magnitudes maiores em relação ao poder de resolução e exatidão de massa, possibilitando a atribuição de fórmulas moleculares a partir das medidas de m/z.101 O poder de resolução de um analisador de massas pode ser definido como a habilidade em produzir sinais distintos no espectro de massas quando são analisados íons que têm uma pequena diferença na razão m/z. O poder de resolução é dado pela equação 1: (equação 1) Em que m representa a massa e ∆m a largura do sinal a meia altura (do inglês, full width at Half maximum, (FWHM)).99 Um analisador com um alto poder de resolução (TOF, FT-ICR MS ou Orbitrap) é capaz de medir a massa exata de cada isótopo mais abundante, assim há a possibilidade da atribuição de fórmulas moleculares para cada sinal resolvido, de acordo com o seu defeito de massa (diferença entre a massa exata e a nominal).124 Para a obtenção de boa acurácia na determinação das massas, geralmente é necessário um espectrômetro de massas de alta resolução, pois interferentes da amostra podem comprometer a acuraria das medidas efetuadas. A exatidão em massa indica o quão próximo o valor experimental está do valor verdadeiro e é geralmente expressada em ppm, pela equação 2.99 (equação 2) 50 Ao se trabalhar com amostras complexas como fluidos biológicos, o uso de técnicas com alto poder de resolução e exatidão de massas torna-se um fator importante na determinação da identidade de compostos com maior segurança e obtenção de resultados mais confiáveis em estudos clínicos. 1.3.4 Processamento de dados e análise estatística Nos experimentos utilizando MS de alta resolução é possível obter conjuntos de dados com muitas informações, que compreendem vários espectros de massas representando intensidades medidas em uma grande quantidade de sinais de m/z, descrevendo até centenas de moléculas diferentes. Quase sempre isso é uma grande vantagem, porém pode se tornar uma limitação, quando um grande conjunto de dados precisa ser avaliado sinal a sinal.64 A grande quantidade de informações geradas pela MS de alta resolução permite a diferenciação de compostos presentes em uma faixa de massa estreita, possibilitando a identificação de uma maior quantidade de possíveis biomarcadores em pesquisas clínicas. Contudo, essa grande quantidade de dados obtidos em espectros de MS requer a combinação da saída desta técnica com estratégias estatísticas robustas para identificar padrões de diagnóstico.89 A combinação de mé