UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA GEÓRGIA AZEVEDO OLIVEIRA TRAICHEL AÇÃO DA MITOQUINONA, UM ANTIOXIDANTE MITOCONDRIAL, SOBRE O METABOLISMO MITOCONDRIAL CARDÍACO APÓS INFARTO AGUDO DO MIOCÁRDIO VITÓRIA, ES 2025 GEÓRGIA AZEVEDO OLIVEIRA TRAICHEL AÇÃO DA MITOQUINONA, UM ANTIOXIDANTE MITOCONDRIAL, SOBRE O METABOLISMO MITOCONDRIAL CARDÍACO APÓS INFARTO AGUDO DO MIOCÁRDIO Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade de Federal do Espírito Santo, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica. Orientador: Prof. Dra. Aurélia A. Fernandes Coorientador: Prof. Dra. Ivanita Stefanon VITÓRIA, ES 2025 \ Dedicatória A Jesus, que Ele me use cada vez mais, permitindo que esses conhecimentos sejam aplicados com amor e dedicação no cuidado com os outros. Ao meu esposo, Washington, e aos meus filhos, Lais e Bernardo, que estiveram ao meu lado, compartilhando cada desafio e me incentivando a seguir em frente. Uma dedicação especial a cada paciente que será beneficiado pelos valiosos conhecimento adquiridos neste mestrado. Que esses aprendizados reflitam em uma prática ainda mais segura, em tratamentos eficazes e no entendimento profundo das causas de suas doenças. Agradecimentos Quero aproveitar esta oportunidade para expressar minha profunda gratidão a todos que fizeram parte da minha jornada ao longo desses dois anos de mestrado. Cada pessoa que cruzou meu caminho deixou uma marca e conquistou um lugar especial no meu coração. Desde o início dessa caminhada, fui acompanhada por um sentimento de imensa gratidão. Primeiramente, a Deus, que me capacitou, fortaleceu e sustentou, concedendo-me sabedoria tanto na prova de seleção quanto em cada etapa deste percurso acadêmico. Sou grata por ter vivido esta experiência e por ter minha fé preservada e meu coração aquietado durante esse tempo. Minha gratidão é imensa ao meu marido, que me incentivou a “encarar” este desafio e me apoiou incondicionalmente em todos os momentos. Obrigada pelo amor, pelas orações, pela paciência, pela compreensão e pela resiliência que, além de me inspirar, me deu forças para concluir este trabalho. Sem você, isso não teria sido possível. Um agradecimento especial à minha filha, Lais Traichel, que abraçou comigo esse projeto, sendo minha companheira e aluna de iniciação cientifica. Seu apoio e dedicação foram fundamentais para a realização desse sonho. Obrigada pelo amor, pelo apoio constante, pelo companheirismo, esforço e dedicação. Sua lealdade e suporte foram fundamentais, sendo meu pilar e estando sempre ao meu lado. Ao meu filho, Bernardo, por todo amor e apoio nesse tempo. Obrigada pela disposição em nos ajudar, pela compreensão e paciência durante os momentos de ausência ao longo do período da pós-graduação. À minha grande amiga, cientista, discípula de Jesus e conselheira Catarine Conti, por ter me apoiado durante todo esse tempo, ensinado, ouvido, incentivado, orado e entregue conselhos sábios. À minha orientadora, Aurélia, dedico um agradecimento especial. Desde o primeiro momento, acreditou na minha capacidade, confiou em meu potencial e me concedeu a oportunidade única e inesquecível de realizar este sonho. Juntas, realizamos um trabalho de pesquisa incrível em uma área desafiadora, mas pela qual sou apaixonada: as mitocôndrias. Muito obrigada ! À minha co-orientadora, Ivanita, expresso minha profunda gratidão pelo ensino, por sua compreensão, incentivo e pelo equilíbrio nos momentos de tensão e desafios naturais desse percurso. Minha gratidão também é enorme ao Eduardo Hertel, meu mentor na mitocôndria. Seus ensinamentos, paciência e disposição em compartilhar conhecimentos foram inestimáveis. Muito obrigada. À Sara Bianca, sou profundamente grata por sua colaboração na execução dos protocolos experimentais. Sua disposição, garra e perseverança foram admiráveis. Obrigada por sua dedicação. Carmen Castardeli e Carol Ximenes, obrigada pelos conselhos, pelo aprendizado e pela companhia nesses momentos intensos de trabalho. A minha amiga Katyana, minha eterna gratidão pelo apoio, paciência, parceria e pelas tantas conversas e desabafos que tornaram esta jornada mais leve. Ana Karol, sua generosidade, disposição em ajudar e ensinar me marcaram profundamente. Obrigada por tudo! Camila, seu apoio na organização dos dados e na pipetagem foram essenciais. Sua colaboração foi muito importante. Muito obrigada. Thiago Spalenza, sua cooperação foi valiosa para este trabalho. Foi um prazer contar com sua colaboração. Marcella, cada detalhe desta pesquisa contou com pessoas especiais ao meu lado. Obrigada por sua ajuda. Ao Maicon Landin, pelas trocas de conhecimento, pela amizade e por ter aceitado ser parte da minha banca. Meu muito obrigada. À Girlandia Brasil, por ser um exemplo para mim, me incentivar a fazer o mestrado, acreditar em mim, e me apoiar sempre que precisei. Obrigada por aceitar meu convite para fazer parte minha banca. Agradecer ao Programa de Pós-graduação em Bioquímica (PPGBiq) e às disciplinas ministradas, que me proporcionaram aprendizado e crescimento acadêmico. Cada professor teve um papel importante nessa caminhada: Profa. Suely Figueiredo, Prof.Renato Graciano, Prof Juliana Barbosa, Profa. Letícia Rangel, Profa Rita Pires, Prof. Marco Cesar, Prof. Jairo Pinto, Prof. Alexandre Martins, Profa. Flavia Errera, Profa. Aurélia e Prof. Athelson. Sentirei falta das aulas, dos desafios e das discussões acadêmicas. Às minhas colegas de turma, Milena, Maria Victoria, Isabela Mancini e especialmente às minhas queridas Ana Paula Passos e Ranna Wanzeler, agradeço pelos momentos compartilhados, pelos incentivos, desabafos, risos e choros, e pela amizade que fez a diferença na nossa trajetória. Damiana, obrigada por sempre nos receber e por sua disposição em ajudar. Maria Eduarda, aluna de iniciação cientifica, sua ajuda foi muito importante. Foi um prazer trabalhar com você. Aos colegas do PPGCF- UFES, Karol Neumann, Nina Mawandji, Renata Ávila, Vinicius e Luiz, e aos demais colegas que não citei, obrigada a todos por me receberem no laboratório, ensinarem e ajudarem sempre que precisei. Aos Professores do PPGCF - UFES, Prof. Mill, Prof. Leonardo dos Santos, Profa. Alessandra, agradeço pelos ensinamentos, pelo pensar científico e pelas boas conversas. Ao veterinário Rodolpho e à equipe de biotério, meu sincero agradecimento pelo atendimento e pela disponibilidade em auxiliar no que foi necessário. Aos funcionários da limpeza, obrigada pelo serviço essencial que nos permitiu trabalhar em um ambiente adequado. Aos professores Marcos e Jairo, obrigada pelo suporte com a água miliq, fundamental para a realização do meu treinamento. À aluna de doutorado Gabi (Gabrielle Silva) por todo apoio, pelas conversas e incentivo. Agradeço a profa. Adriana Madeira pela oportunidade de estarmos mais perto e compartilhar momentos de aprendizado e amizade. Aos animais utilizados neste estudo, deixo meu reconhecimento e respeito. A pesquisa científica exige desafios éticos, e meu compromisso esteve em que nunca nos faltasse respeito e responsabilidade na condução dos experimentos. Agradeço à FAPES pela concessão da bolsa de mestrado e pelo apoio financeiro para a realização desta pesquisa, assim como ao CNPq e à Capes pelo incentivo à ciência e pesquisa no Brasil. A todos os meus familiares por todo amor e paciência comigo e por suportarem a minha ausência. À minha família de irmãos em Cristo, que sentiram muito a minha falta, obrigada pela compreensão e apoio. A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para esta conquista, meu sincero e eterno agradecimento. “Por isso, não tema, pois estou com você; não tenha medo, pois sou o seu Deus. Eu o fortalecerei e o ajudarei; eu o segurarei com a destra da minha justiça.” Isaias 41,10 RESUMO A doença cardíaca isquêmica é uma das principais causas de insuficiência cardíaca (IC), sendo as mitocôndrias elementos centrais na progressão dessa condição. O estresse oxidativo mitocondrial, as alterações nas vias bioenergéticas cardíacas e a ativação de vias apoptóticas constituem fatores-chave desse processo. Nesse contexto, torna-se necessário identificar estratégias terapêuticas capazes de atuar diretamente sobre a disfunção mitocondrial. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da mitoquinona na função mitocondrial de ratos infartados tratados por sete dias. Foram utilizados ratos Wistar, com idade entre 10 e 12 semanas, separados aleatoriamente em 3 grupos: Sham, IM e IM MitoQ. Os animais foram submetidos a cirurgia para indução de infarto do miocárdio (IM) ou a um procedimento cirúrgico fictício (Sham). O tratamento com mitoquionona (MitoQ) foi administrado na água de beber por sete dias. A função cardíaca foi avaliada por ecocardiografia e os dados ponderais foram analisados. Como esperado, o grupo IM apresentou redução da fração de ejeção e hipertrofia do ventrículo direito, efeitos que não foram revertidos pelo tratamento. Por outro lado, o MitoQ atenuou a congestão pulmonar. Além disso, o grupo IM apresentou uma redução de aproximadamente 50% do rendimento proteico mitocondrial (YIELD), que não foi restaurado com o tratamento de curto prazo. Apesar disso, o MitoQ restaurou o aumento da retenção de cálcio mitocondrial, melhorou o acoplamento mitocondrial e a capacidade de síntese de ATP, otimizou a função do complexo I e restabeleceu a oxidação. Assim, nossos achados mostram que o MitoQ foi capaz de mitigar alterações associadas à disfunção mitocondrial e pode representar uma promissora estratégia terapêutica complementar para o tratamento da doença cardíaca isquêmica, podendo favorecer o remodelamento cardíaco após o infarto. Palavras-chave: insuficiência cardíaca; infarto agudo do miocárdio; disfunção mitocondrial; mitoquinona; MitoQ; mitocôndrias interfibrilares; mitocôndrias subsarcolemais. ABSTRACT Ischemic heart disease is one of the leading causes of heart failure (HF), with mitochondria playing a central role in the progression of this condition. Mitochondrial oxidative stress, alterations in cardiac bioenergetic pathways, and the activation of apoptotic signaling in cardiac tissue are key contributors of this process. In this context, identifying therapeutic strategies capable of directly targeting mitochondrial dysfunction is essential. This study aimed to evaluate the effects of mitoquinone (MitoQ) on mitochondrial function in infarcted rats treated for seven days. Male Wistar rats (aged 10 to 12 weeks) were randomly assigned to three groups: Sham, MI and MI MitoQ. Animals underwent surgery for myocardial infarction (MI) induction or a sham surgical procedure. Mitoquinone (MitoQ) treatment was administered in drinking water for seven days. Cardiac function was assessed by echocardiography, and weight data were analysed. As expected, the MI group showed a reduced ejection fraction and right ventricular hypertrophy, effects that were not reversed by the treatment. However, MitoQ attenuated pulmonary congestion. Additionally, the MI group exhibited an approximately 50% reduction in mitochondrial protein yield (YIELD), which was not restored with short-term treatment. Nevertheless, MitoQ improved mitochondrial calcium retention, enhanced mitochondrial coupling and ATP synthesis capacity, optimized complex I function, and reestablished beta-oxidation. Therefore, our findings suggest that MitoQ was effective in mitigating changes associated with mitochondrial dysfunction and may represent a promising complementary therapeutic strategy for ischemic heart disease, potentially supporting cardiac remodeling after infarction. Keywords: heart failure; acute myocardial infarction; mitochondrial dysfunction; mitoquinone; MitoQ; intermyofibrillar mitochondria; subsarcolemmal mitochondria. RESUMO PARA COMUNIDADE EM GERAL A doença cardíaca isquêmica é uma das principais causas de insuficiência cardíaca e ocorre quando o coração não recebe sangue e oxigênio suficientes devido a uma obstrução das artérias. Com o tempo, isso pode levar a prejuízos nas células do coração, afetando seu funcionamento. As mitocôndrias, conhecidas como as “usinas de energia” das células, desempenham um papel essencial na saúde do coração, mas podem ser prejudicadas pela falta de oxigênio e pelo estresse oxidativo. Neste estudo, avaliamos os efeitos da mitoquinona (MitoQ), um composto antioxidante que protege as mitocôndrias, em ratos com infarto. Durante sete dias, os animais receberam MitoQ na água de beber e foram acompanhados para avaliar sua função cardíaca. Observamos que, apesar de a mitoquinona não reverter totalmente os danos no coração, ela ajudou a reduzir a congestão pulmonar e melhorou a capacidade das mitocôndrias de produzir energia e regular o cálcio. Esses efeitos podem ajudar a desacelerar a progressão da insuficiência cardíaca. Os resultados sugerem que a mitoquinona pode ser uma estratégia promissora para complementar os tratamentos da doença cardíaca isquêmica, ajudando a proteger as células do coração e melhorando sua função. Mais estudos são necessários para entender como essa substância pode beneficiar os pacientes no futuro. LISTA DE FIGURAS Figura 1 Prevalência de Doença Cardíaca Isquêmica na População Global., Acidente vascular cerebral isquêmico (AVCI); Acidente vascular cerebral hemorrágico (AVCH) ……............................................................................................................................ 34 Figura 2 Representação esquemática do remodelamento cardíaco mediado por estresse mecânico e resposta neuroendócrina. O aumento da demanda energética cardíaca, associado à ativação do sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA) e da via β-adrenérgica, estimula a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) pelas mitocôndrias. Durante a fase de hipertrofia cardíaca compensada, ocorre um aumento na biogênese mitocondrial que ajuda a manter o débito cardíaco. Entretanto, a ativação sustentada dessas vias leva à disfunção mitocondrial, danos ao DNA mitocondrial (mtDNA) e redução da biogênese mitocondrial, comprometendo a bioenergética e levando à transição para IC. Este processo é marcado por alterações no metabolismo energético, redução da contratilidade e queda do débito cardíaco …………………………………………………..........................................……..............39 Figura 3 Terapias atuais para IC. As terapias atuais frequentemente não abordam a disfunção mitocondrial como causa subjacente da progressão para IC. Adenosina trifosfato (ATP); Inibidores da enzima conversora da angiotensina (IECA); Bloqueadores do receptor da angiotensina (BRA); Inibidores do cotransportador sódio- glicose tipo 2 (ISGLT2)...............................................................................................40 Figura 4 Estrutura Geral da Mitocôndria……..………………………...………………..42 Figura 5 Componentes estruturais e funcionais da mitocôndria cardíaca (vide explicação no texto). Canal aniônico dependente de voltagem (VDAC); transportador de nucleotídeo de adenina (ANT); transportador de fosfato (PiC); creatina quinase (CK); fosfato inorgânico (Pi); creatina (Cr); proteína desacopladora (UCP); citocromo c (Cyt c); coenzima Q (CoQ)......................................................................................43 Figura 6 Metabolismo Mitocondrial Cardíaco. A figura ilustra a glicólise, a β-oxidação e os principais transportadores e enzimas do metabolismo cardíaco, incluindo: enzima carnitina palmitoiltransferase I (CPT-I, transporte de ácidos graxos); transporte de glicose (GLUT); transportador de lactato (MCT1); piruvato desidrogenase (PDH, metabolismo de carboidratos).....................................................................................45 Figura 7 A lançadeira malato-aspartato é essencial para transferir prótons do NADH citosólico para a mitocôndria. Seu funcionamento é reduzido ou interrompido no coração em condições de isquemia ou de IC………………………......…...................47 Figura 8. Inter-relação entre a oxidação de substratos, a redução de NAD+/FAD+ no ciclo do ácido cítrico, o transporte de elétrons na cadeia transportadora de elétrons, e a síntese e hidrólise de ATP. Nicotinamida adenina dinucleotídeo oxidado (NAD+); nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido (NADH); adenosina trifosfato (ATP); adenosina difosfato (ADP); fosfato inorgânico (Pi).....................................................51 Figura 9 Sistema de transferência de energia no coração (detalhes no texto). A fosfocreatina (PCr) atua como um meio eficiente de transmissão de energia para locais periféricos de utilização de ATP. A linha vermelha tracejada indica uma via alternativa de transferência de ATP menos provável, já que a difusão do ATP diretamente é limitada……………………...............................................................….52 Figura 10 Transporte de cálcio e importância do ATP na célula cardíaca. A figura ilustra os principais mecanismos de transporte de cálcio e o papel do ATP na manutenção da função cardíaca (vide explicação no texto).......................................53 Figura 11 O duplo papel do ATP na contratilidade e relaxamento – O ATP fornece energia essencial para o deslizamento entre actina e miosina, permitindo tanto a contração quanto o relaxamento muscular. Na ausência ou redução de ATP, o músculo entra em um estado de rigidez durante a fase de relaxamento…………….54 Figura 12 Subpopulações Mitocondriais Cardíacas. As mitocôndrias subsarcolemais (SSM) estão localizadas abaixo do sarcolema, enquanto as mitocôndrias interfibrilares (IFM) estão distribuídas entre as miofibrilas, com funções adaptadas às suas localizações específicas.............................................................................................55 Figura 13 Esquema das subpopulações mitocondriais cardíacas. As IFM estão localizadas entre as linhas Z e próximas ao RS juncional (RSj), enquanto as SSM estão posicionadas sob o sarcolema, onde fornecem energia para os processos metabólicos relacionados ao transporte de íons na membrana plasmática. As mitocôndrias perinucleares foram omitidas para simplificação do esquema. Receptores de rianodina (RYR2); ATPase de cálcio do RS (SERCA2a).................................................................................................................57 Figura 14 O cálcio mitocondrial e sua regulação do metabolismo energético. O aumento do cálcio modula a atividade de enzimas-chave, como a piruvato desidrogenase (PDH), isocitrato desidrogenase (ICDH) e α-cetoglutarato desidrogenase (α-KDH)............................................................................................. 58 Figura 15 Fontes de espécies reativas de oxigênio mitocondriais (ERO)..................60 Figura 16 Alterações na ATP sintase induzidas pelo cálcio. Esse modelo sugere que a abertura do mPTP ocorre na porção Fo da ATP sintase. Subunidade proteica conferente de sensibilidade à oligomicina (OSCP)....................................................62 Figura 17 Estrutura e funcionamento do mPTP. A figura ilustra o modelo formado por dímeros da ATP sintase, com sua dissociação formando um canal de alta condutância. As funções fisiológicas e patológicas do mPTP no coração estão resumidas nessa figura. Transportador de nucleotídeo de adenina (ANT); transportador de fosfato (PiC); subunidade proteica conferente de sensibilidade à oligomicina (OSCP).......................................................................................................................62 Figura 18 Representação esquemática da transição do mPTP em condições de baixa e alta condutância. À esquerda, em baixa condutância, observa-se o ciclo de abertura transitória do mPTP, permitindo o efluxo controlado de cálcio e ERO, além da entrada de íons H+, regulando o potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) e evitando o acúmulo excessivo de ERO. À direita, em alta condutância, ocorre a despolarização persistente da membrana, inchaço mitocondrial, vazamento do conteúdo interno e ativação de vias de morte celular (necrose ou apoptose), bem como estímulo à mitofagia. Membrana mitocondrial externa (MME); espaço intermembrana (EIM); membrana mitocondrial interna (MMI); ciclo do ácido cítrico (CAC).........................................................................................................................65 Figura 19 Representação esquemática do papel do cálcio e das ERO na disfunção mitocondrial. Altas concentrações de cálcio, mesmo na ausência de ERO, induzem a abertura de mPTP, regulada por proteínas como a ciclofilina D e pelo ANT. Por outro lado, altos níveis de ERO, ainda que na ausência de cálcio, causam ruptura mitocondrial por peroxidação lipídica. Níveis subtóxicos de ERO sensibilizam o mPTP, reduzindo o limiar de cálcio necessário para a sua abertura…………………………………………………………………………….….........66 Figura 20 Biogênese mitocondrial no cardiomiócito. A figura destaca os mecanismos de biogênese mitocondrial e a interação entre os genomas nuclear e mitocondrial. Ligantes ativam receptores nucleares (PPAR/RXR), enquanto coativadores (PGC-1α) e fatores transcricionais (NRF-1, NRF-2 e TFAM) regulam a replicação do mtDNA e a síntese de proteínas da cadeia respiratória (OXPHOS). Além disso, os processos de fusão (MFN1, MFN 2 e OPA-1) e fissão (Drp1, Fis1) preservam a função mitocondrial e cardíaca. Receptor α ativado por proliferador de peroxissoma (PPARα); fatores respiratórios nucleares (NRF1/2); receptores de estrogênio (ERRS); receptor de retinóide X (RXR)........................................................................................................68 Figura 21 Representação da estrutura química e do mecanismo de ação da mitoquinona. A figura destaca sua ligação ao cátion trifenilfosfônio, que facilita sua acumulação seletiva nas mitocôndrias, bem como o ciclo regenerativo entre ubiquinona e ubiquinol, essencial para a neutralização de ERO e proteção contra danos oxidativos……………………………..……........................................................72 Figura 22 Grupos Experimentais – Distribuição aleatória dos animais em três grupos experimentais, conforme ilustrado. * Ligadura do ramo interventricular anterior da artéria coronária esquerda………………………………………………….....................86 Figura 23 Delineamento Experimental – ilustração do protocolo de tratamento com mitoquinona por 7 dias………………………………………………………................…86 Figura 24 (a) Ligadura do ramo interventricular anterior da artéria coronária esquerda. (b) Descoloração do tecido cardíaco evidenciando a área de infarto do miocárdio……………………………………………………………………………...….....87 Figura 25 (a) Técnica de transiluminação com visualização da área de infarto. (b) Medida da área de infarto por planimetria………………………………………............91 Figura 26 Isolamento mitocondrial (Parte 1): Após lavagem do VE com tampão gelado (Chappel-Perry 1), o tecido foi picotado e homogeneizado em tampão (Chappel-Perry 2) para liberação das mitocôndrias localizadas sob o sarcolema. Os homogenatos foram submetidos a centrifugações seriadas para separar as subpopulações. Como resultado, foi formado o pellet correspondente à subpopulação SSM. O pellet das mitocôndrias interfibrilares foi reservado para processamento na segunda etapa……..........................................................…………………….............................92 Figura 27 Isolamento mitocondrial (Parte 2): O pellet da subpopulação IFM foi ressuspendido em tampão Chappel-Perry 1 e tratado com tripsina para digestão das miofibrilas, liberando as mitocôndrias interfibrilares. Após homogeneização, foi realizada a centrifugação inicial. Em seguida, foi adicionado tampão Chappel-Perry 2 para inibir a tripsina, e as amostras passaram por novas etapas de centrifugação seriada. O pellet final obtido corresponde à subpopulação IFM.……………….........93 Figura 28 Atividade da enzima citrato sintase. Alíquotas de mitocôndrias foram incubadas em tampão contendo ácido 2-nitrobenzóico, que reage com a Coenzima A livre liberada após a reação da acetil-CoA com oxaloacetato, formando um composto amarelo detectado a 405nm. A atividade de CS foi monitorada pela alteração de absorvância e expressa como µmoles de ácido 2-nitrobenzóico/min/mg de proteína………………………………….........................................………....................95 Figura 29 Citometria de fluxo. A citometria de fluxo foi utilizada para avaliar o potencial de membrana, tamanho e complexidade interna das subpopulações mitocondriais isoladas (IFM e SSM). Amostras foram incubadas em tampão KME com os marcadores fluorescentes JC-1 e MitoTracker Deep Red 633, que dependem diretamente do potencial de membrana para sua acumulação. Como controle negativo, foi utilizado o CCCP, um desacoplador que despolariza a membrana mitocondrial. O esquema ilustra a organização experimental, destacando as amostras tratadas com marcadores fluorescentes e aquelas adicionadas CCCP para controle………………………………………………………………….......………………98 Figura 30 Método Fluorimétrico – A capacidade de retenção de cálcio pelas subpopulações mitocondriais (IFM e SSM) foi analisada pelo método fluorimétrico. Amostras foram incubadas em tampão livre de cálcio contendo os substratos glutamato e malato ou rotenona e succinato. O fluoróforo Calcium Green foi adicionado, seguido de 32 doses de cálcio, com intervalos de 7 minutos. A fluorescência foi monitorada continuamente em um espectrofotômetro de fluorescência……..………………………………………………..................................100 Figura 31 A avaliação funcional dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial foi realizada com o auxílio de um transdutor para medida de oxigênio (Clark electrode, Qubit System, Canada) que avalia o consumo de oxigênio (O2).............................101 Figura 32 Avaliação da Respiração Celular. Análise do consumo de oxigênio nos Estados 1 a 4. O Estado 3 representa a produção máxima de ATP, enquanto o Estado 4 corresponde ao consumo basal de oxigênio após depleção do ADP. A razão de controle respiratório (RCR) é calculada pela relação entre o consumo de oxigênio nos Estados 3 e 4, indicando o acoplamento da cadeia respiratória…..........................102 Figura 33 Diagrama esquemático dos procedimentos realizados no estudo…...…104 Figura 34 Homogeneidade dos grupos em relação à área de infarto e à redução da fração de ejeção. (a) Área de Infarto (b) Fração de Ejeção %. Todos os valores estão representados pela média ± EPM. A análise estatística foi realizada com o teste T de Student para a área de infarto e com a Anova uma via e pós-teste de Tukey para afração de ejeção; **** p < 0,0001………………………………………………………109 Figura 35 Rendimento Proteico (YIELD). (a) YIELD interfibrilar - IFM (b) YIELD subsarcolemmal - SSM (c) YIELD total. O rendimento proteico foi significativamente reduzido nos grupos IM e IM MitoQ em ambas as subpopulações (IFM e SSM) em comparação com o grupo Sham. Os dados são expressos como média ±EPM. A análise estatística foi realizada por Anova uma via, seguida de pós-teste de Tukey. *p < 0,05; **p < 0,01……………................................................................................111 Figura 36 Atividade da Citrato Sintase no VE. Os grupos infartados exibem uma redução significativa na atividade da CS em comparação com o grupo Sham. Esse resultado está associado a um menor conteúdo mitocondrial total no miocárdio. Os dados são expressos como média ±EPM. A análise estatística foi realizada por Anova uma via, seguida de pós-teste de Tukey. **p < 0,01; .***p < 0,001…...…...........….112 Figura 37 Atividade da Citrato Sintase em mitocôndrias isoladas. (a) CS IFM (b) CS SSM. Não observamos diferenças entre os grupos em nenhuma das subpopulações mitocondriais, sugerindo preservação do conteúdo mitocondrial e uma mesma capacidade respiratória. Os dados são expressos como média ±EPM. A análise estatística foi realizada por Anova uma via, seguida de pós-teste de Tukey. Κ : dados não normais, utilizado teste de Kruskal-Wallis. …………………………..............…..113 Figura 38. Proteínas relacionadas à Biogênese Mitocondrial. (a) NRF1 IFM (b) TFAM IFM (c) MFN2 IFM (d) NRF1 SSM (e) TFAM SSM (f) MFN2 SSM. Os dados são expressos como média ±EPM. A análise estatística foi realizada por Anova uma via, seguida de pós-teste de Tukey………………….................…………………………...115 Figura 39 Medida indireta do potencial de membrana. (a) Basal IFM (b) Marcador JC- 1 IFM (c) Desacoplador mitocondrial CCCP IFM (d) Basal SSM (e) Marcador JC-1 SSM (f) Desacoplador mitocondrial CCCP SSM. Os dados são expressos como média ±EPM. A análise estatística foi realizada por Anova uma via, seguida de pós-teste de Tukey…….............................................................................................................…116 Figura 40 Medida indireta do tamanho e complexidade interna das mitocôndrias. (a) e (c) Tamanho Mitocondrial; (b) e (d) Complexidade interna da mitocôndria. Nota-se que a complexidade interna foi significativamente maior no grupo IM MitoQ em comparação ao grupo Sham nas IFM. Os dados são expressos como média ±EPM. A análise estatística foi realizada por Anova uma via, seguida de pós-teste de Tukey. *p < 0,05. Κ : dados não normais, utilizado teste de Kruskal- Wallis………………………………………………………….………….........................117 Figura 41 Probabilidade de abertura do poro mitocondrial e capacidade de retenção de cálcio. (a) IFM com glutamato e malato. (b) IFM com rotenona e succinato. O grupos IM apresentaram desvio à direita, e os grupos tratados com mitoquinona demonstraram uma captação semelhante à do grupo Sham. Os dados são expressos como média ±EPM. A análise estatística foi realizada por Anova uma via, seguida de pós-teste de Tukey. *p < 0,05. &p < 0,05……………………………………................119 Figura 42 Probabilidade de abertura do poro mitocondrial e capacidade de retenção de cálcio. (a) SSM com glutamato e malato. (b) SSM com rotenona e succinato. O grupos IM apresentaram desvio à direita em alguns pontos da curva, e os grupos tratados com mitoquinona demonstraram uma captação semelhante à do grupo Sham. Os dados são expressos como média ±EPM. A análise estatística foi realizada por Anova uma via, seguida de pós-teste de Tukey. *p < 0,05. &p < 0,05……………....120 Figura 43 Avaliação da Enzima Antioxidante SOD2. (a) Subpopulação IFM. (b) Subpopulação SSM. OS dados são expressos como média ±EPM. A análise estatística foi realizada por Anova uma via, seguida de pós-teste de Tukey…....…120 Figura 44 Avaliação da fosforilação oxidativa com os substratos glutamato e malato na subpopulação mitocondrial IFM.(a) Estado 3 (b) Estado 4 (c) RCR (d) Capacidade oxidativa total (e) Razão ADP:O. Foi medido o consumo de oxigênio no Estado 3 (na presença de ADP) e no Estado 4 com oligomicina (sem ADP e com oligomicina) e calculado a razão de controle respiratório (RCR); IM – infarto; M+G – Malato + Glutamato. Dados expressos como média ±EPM. A análise estatística foi realizada com a Anova uma via e pós-teste de Tukey. * p < 0,05, ** p < 0,01……………..….121 Figura 45 Avaliação da fosforilação oxidativa com os substratos glutamato e malato na subpopulação mitocondrial SSM. (a) Estado 3 (b) Estado 4 (c) RCR (d) Capacidade oxidativa total (e) Razão ADP:O.; IM – infarto; M+G – Malato + Glutamato. Dados expressos como média ±EPM. A análise estatística foi realizada com a Anova uma via e pós-teste de Tukey. * p < 0,05, ** p < 0,01. Κ : dados não normais, utilizado teste de Kruskal-Wallis…..................................................................................................122 Figura 46 Avaliação da Fosforilação Oxidativa com os substratos malato e palmitoilcarnitina na subpopulação mitocondrial IFM. (a) Estado 3 (b) Estado 4 (c) RCR (d) Capacidade oxidativa total (e) Razão ADP:O. Foi medido o consumo de oxigênio no Estado 3 (na presença de ADP) e no Estado 4 com oligomicina (sem ADP e com oligomicina) e calculado a razão de controle respiratório. Dados expressos como média ±EPM. A análise estatística foi realizada com Anova uma via e pós-teste de Tukey; * p < 0,05, ** p < 0,01. Κ : dados não normais, utilizado teste de Kruskal- Wallis........................................................................................................................123 Figura 47 Avaliação da Fosforilação Oxidativa com os substratos malato e palmitoilcarnitina na subpopulação mitocondrial SSM. (a) Estado 3 (b) Estado 4 (c) RCR (d) Capacidade oxidativa total (e) Razão ADP:O. Dados expressos como média ±EPM. A análise estatística foi realizada com Anova uma via e pós-teste de Tukey. * p < 0,05…............................................................................................................................124 Figura 48 Avaliação da Fosforilação Oxidativa com os substratos malato e piruvato na subpopulação mitocôndrial IFM. (a) Estado 3 (b) Estado 4 (c) RCR (d) Capacidade oxidativa total (e) Razão ADP:O. Dados expressos como média ±EPM. A análise estatística foi realizada com a Anova uma via e pós-teste de Tukey; * p < 0,05, ** p < 0,01. Κ : dados não normais, utilizado teste de Kruskal- Walli……………………………………………………………………..............…………124 Figura 49 Avaliação da Fosforilação Oxidativa com os substratos malato e piruvato na subpopulação mitocondrial SSM. (a) Estado 3 (b) Estado 4 (c) RCR (d) Capacidade oxidativa total (e) Razão ADP:O. Dados expressos como média ±EPM. A análise estatística foi realizada com a Anova uma via e pós-teste de Tukey. * p < 0,05, ** p < 0,01. Κ : dados não normais, utilizado teste de Kruskal- Wallis……………………………………………………………………………................127 Figura 50 Avaliação da Fosforilação Oxidativa com os substratos rotenona e succinato na subpopulação mitocondrial IFM. (a) Estado 3 (b) Estado 4 (c) RCR (d) Capacidade oxidativa total (e) Razão ADP:O. Foi medido o consumo de oxigênio nos Estados 3 (na presença de ADP) e no Estado 4 com oligomicina (sem ADP e com oligomicina) e calculado a razão de controle respiratório. Dados expressos como média ±EPM. A análise estatística foi realizada com Anova uma via e pós-teste de Tukey. * p < 0,05. Κ : dados não normais, utilizado teste de Kruskal-Wallis………...............................128 Figura 51 Avaliação da Fosforilação Oxidativa com os substratos rotenona e succinato na subpopulação mitocondrial SSM. (a) Estado 3; (b) Estado 4; (c) RCR; (d) Capacidade oxidativa total; (e) Razão ADP:O. Dados expressos como média ±EPM. A análise estatística foi realizada com a Anova um via e pós-teste de Tukey. Κ : dados não normais, utilizado teste de Kruskal-Wallis.……..………………...…...............…129 Figura 52 Resumo esquemático do protocolo experimental e principais desfechos do tratamento como mitoquinona após IM. O tratamento com MitoQ reduziu a congestão pulmonar, mas não restaurou a função contrátil ou preveniu a hipertrofia do ventrículo direito.……………………………..……...……………………….….…......................…131 Figura 53 Síntese dos dados: rendimento proteico mitocondrial, marcadores de biogênese e dinâmica mitocondrial, além do potencial de membrana e morfologia mitocondrial. Semelhante ao Sham: ; Aumentado (prejudicial): ; Aumentado (benéfico): ; Reduzido (prejudicial): .O número de setas representa a significância estatística:1 seta p < 0,05; 2 setas p < 0,01. Yield (rendimento mitocondrial); Tfam; NRF-1; MFN-2, SOD2.……………...........................................................................134 Figura 54. Representação esquemática das alterações mitocondriais causadas pelo IM e o impacto do tratamento com mitoquinona (IM MitoQ) nas subpopulações interfibrilar (IFM) e subsarcolemal (SSM). (a) IFM em condição de IM, apresenta aumento da retenção de cálcio, maior produção de ERO, vazamento de prótons e disfunção do complexo I. O tratamento com MitoQ (b) promove redução do estresse oxidativo, melhoria da bioenergética e otimização do metabolismo redox. (c) SSM no IM apresenta alterações semelhantes às IFM, com destaque para o desacoplamento da glicólise, mostrando que o MitoQ (d) apresenta efeito limitado sobre essa alteração, destacando a resposta diferencial entre as subpopulações mitocondriais ao antioxidante.………………………………...………….................................................137 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Estudos sobre o uso da mitoquinona em diferentes modelos experimentais de doenças cardiovasculares.………………………………………………………………………….80 Tabela 2 Dados Ecocardiográficos.……………………………………………………………....105 Tabela 3 Peso Corporal.……………………………………………………….……….……….…107 Tabela 4 Avaliação do peso pulmonar.……………………………………………….……….…107 Tabela 5 Avaliação dos ventrículos e da área de infarto.…………………………………...…109 Tabela 6 Ingestão hídrica e alimentar.…………………………………………………………...110 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ADP – Adenosina difosfato AMP – Adenina mononucleotideo AMPK – Adenina mononucleotideo quinase ANT – Transportador (translocase) de nucleotídeo de adenina ATP – Adenosina trifosfato AVCI - Acidente vascular cerebral isquêmico AVCH - Acidente vascular cerebral hemorrágico CAC – Ciclo do ácido cítrico CS – Citrato Sintase CK – Creatina quinase CKmt – Creatina quinase mitocondrial CO2 – Dióxido de carbono Co-A – Coenzima A CoQ – Coenzima Q CPT-I – Carnitina palmitoiltransferase CTE – Cadeia transportadora de elétrons DAC - doença arterial coronariana DCI – Doença cardíaca isquêmica DCV – Doença cardiovascular EGTA - Ácido etileno-bis(oxietilenonitrilo)tetracético ERO – Espécies reativas de oxigênio F2,6BP – Frutose 2,6 bifosfato FAD+ - Flavina-adenina dinucleotídeo oxidado FADH2 – Flavina-adenina dinucleotídeo reduzido GAPDH – Enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase GLUT 1 / GLUT 4 – transportadores de glicose na membrana celular H2O – Água H2O2 – Peróxido de Hidrogênio IC – Insuficiência cardíaca ICDH – Isocitrato desidrogenase IFM – Mitocôndria Interfibrilar IM – Infarto do miocárdio IR – Isquemia – reperfusão KCL – Cloreto de potássio MCU – Uniporter de cálcio mitocondrial MEC - matriz extracelular MFN2- Mitofunsina 2 MitoQ – nome comercial da mitoquinona MgSO4 – Sulfato de magnésio MME – Membrana mitocondrial externa MMI – Membrana mitocondrial interna MOPS - Ácido 3-(N-morfolino) propanossulfônico, Ácido 4-morfolino propanossulfônico mPTP – Poro de transição de permeabilidade mitocondrial NAD+ - Nicotinamida adenina dinucleotídeo oxidado NADH – Nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido NCX – Trocador Na+/Ca2+ NO – Óxido nítrico NRF1- Fator nuclear respiratório 1 NSTEMI - IM sem elevação do segmento ST O2 − - Radical livre superóxido OH – Radical hidroxila P/O – Razão fosforo/oxigênio PCr – Fosfocreatina PDH – Piruvato desidrogenase PDK – Piruvato desidrogenase quinase PFK-1 – Fosfofrutoquinase-1 PFK-2 – Fosfofrutoquinase – 2 Pi – Fosfato inorgânico PMCA - Cálcio -ATPase da membrana plasmática QH – Radical semiquinona QH2 - Ubiquinol (Coenzima Q reduzida) RS – Retículo sarcoplasmático RyR2 – Receptores de rianodina SERCA2a – Calcio-ATPase do retículo sarcoplasmático SRAA - sistema renina-angiotensina-aldosterona SSM – Mitocôndria Subsarcolemal STEMI - IM com elevação do segmento ST TFAM – Fator de transcrição mitocondrial A UDMI - Quarta Definição Universal de IM uM – Micromolar VE – Ventrículo esquerdo α-KDH - α-cetoglutarato desidrogenase ΔΨ m – Potencial de membrana SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO …………………………………………………………………………………... 32 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA…………………………………………………………………… 34 2.1 Doença Cardíaca Isquêmica: Dados Epidemiológicos e Evolução para IC……… 34 2.2 Fatores de Risco da DCI……………………………………...……………………………… 35 2.3 A Doença Cardíaca Isquêmica (DCI)……………………………………………………… 35 2.3.1 O Remodelamento Cardíaco no Contexto do IM e sua Progressão para IC…… 36 2.3.1.1 Da Hipertrofia Cardíaca à IC…………………………………………………………… 37 2.4 As Mitocôndrias Cardíacas………………………………………………………………… 41 2.4.1 Aspectos Estruturais e Funcionais da Mitocôndria Cardíaca……………………… 41 2.4.2 Funções Metabólicas e Regulação……………………………………………………… 44 2.4.3 A Lançadeira Malato-Aspartato……………………………………………………….… 47 2.4.4 O Ciclo do Ácido Cítrico……………………………………………………………...…… 48 2.4.5 A fosforilação oxidativa e a Taxa de Controle Respiratório………………………… 49 2.4.5.1 A Importância do ATP na Célula Cardíaca…………………………………………… 52 2.4.6 As Subpopulações Mitocondriais……………………………………………………… 55 2.4.8 Espécies Reativas de Oxigênio (ERO) na Mitocôndria Cardíaca…………………. 59 2.4.9. O Poro de Transição de Permeabilidade Mitocondrial (mPTP).............................. 61 2.4.9.1 Estrutura e Funcionamento…………………………………………………………….. 61 2.4.9.2 Regulação Fisiológica e Patológica do mPTP………………………………………. 63 2.4.9.3 Relação entre ERO, Sobrecarga de Cálcio e mPTP……………………………... 66 2.4.10. A Dinâmica Mitocondrial e a Regulação da Expressão Gênica no Cardiomiócito 65 2.5 Antioxidante mitocondrial específico (mitoquinona – MitoQ)................................... 71 2.5.1 Introdução aos Antioxidantes…………………………………………………………… 71 2.5.2 Mitoquinona: Estrutura e Mecanismo de Ação……………………………………….. 72 2.5.3 Efeitos da mitoquinona em Doenças Cardiovasculares……………………………. 73 2.5.4. Doses e Vias de administração…………………………………………………………. 74 2.5.5 Modelos Experimentais……………………………………………………………………. 75 2.5.5.1 Modelo de Isquemia-reperfusão………………………………………………………. 75 2.5.5.2. Modelos de IC por Sobrecarga de Pressão e Volume…………………………….. 76 2.5.5.3. Modelos Experimentais Diversificados com Mitoquinona……………………… 77 2.5.6 Estudos em Humanos…………………………………………………………………….. 79 3. OBJETIVOS………………………………………………………………………………………. 84 3.1 Objetivo geral………………………………………………………………………………….. 84 3.2 Objetivos específicos………………………………………………………………………… 84 4. MATERIAIS E MÉTODOS…………………………………………………………………….... 85 4.1 Animais experimentais……………………………………………………………………….. 85 4.2 Grupos Experimentais……………………………………………………………………….. 85 4.3 Delineamento Experimental……………………………………………………………….... 86 4.4 Cirurgia de indução do Infarto Agudo do Miocárdio (IM)........................................... 87 4.5 Tratamento com Mitoquinona………………………………………………………………. 88 4.6 Avaliação Ecocardiográfica…………………………………………………………………. 88 4.7 Avaliação Ponderal…………………………………………………………………………… 89 4.7.1 Critérios de Inclusão baseados em IC………………………………………………….. 90 4.8 Avaliação da Área de Infarto do Miocárdio……………………………………………… 90 4.9 Isolamento Mitocondrial…………………………………………………………………….. 91 4.9.1 Atividade da Enzima Citrato Sintase……………………………………………………. 94 4.9.2 Avaliação Proteica pela Técnica de Western Blotting………………………………. 96 4.9.3 Medidas do Potencial de Membrana, Tamanho e Complexidade Interna da Mitocôndria………………………………………………………………………………………… 97 4.9.4 Capacidade de Retenção de Cálcio e Probabilidade de Abertura do mPTP……. 99 4.9.5 Avaliação Funcional da Cadeia Respiratória………………………………………… 100 4.10 Análise Estatística dos Dados…………………………………………………………… 103 5. RESULTADOS………………………………………………………………………………….. 104 5.1 Taxa de Mortalidade…………………………………………………………………………. 104 5.2 Dados Ecocardiográficos………………………………………………………………….. 105 5.3 Dados Ponderais……………………………………………………………………………. 106 5.3.1 Avaliação Ponderal……………………………………………………………………… 106 5.3.2 Avaliação do Peso Pulmonar………………………..………………………………… 107 5.3.3 Avaliação dos Pesos das Câmaras Cardíacas e da Área de Infarto…………… 108 5.5 Avaliação após Isolamento Mitocondrial……………………………………………… 110 5.5.1 Rendimento Proteico (YIELD)……………………………………………………..…… 111 5.5.2 Atividade da Citrato Sintase (CS)……………………………………………………… 111 5.5.3 Subpopulações Mitocondriais (IFM e SSM)………………………………………… 113 5.5.3.1 Proteínas relacionadas à Biogênese Mitocondrial……………………………… 114 5.5.3.2 Potencial de Membrana (ΔΨ m ), tamanho e Complexidade Interna da Mitocôndria…………………………………………………...…………………………………… 116 5.5.3.3 Capacidade de Retenção de Cálcio e Probabilidade de Abertura do Poro Mitocondrial (IFM e SSM)……………………………………………………………………… 118 5.5.3.4 Avaliação da SOD2 (IFM)……………………………………………………………… 120 5.5.3.5 Fosforilação Oxidativa………………………………………………………………… 121 5.5.3.5.1 Respiração Celular com Glutamato e Malato (IFM e SSM).............................. 121 5.5.3.5.2 Respiração Celular com Palmitoilcarnitina e Malato (IFM e SSM).................. 123 5.5.3.5.3 Respiração Celular com Piruvato e Malato (IFM e SSM).................................. 125 5.5.3.5.4 Respiração Celular com Rotenona e Succinato………………………………… 127 6. DISCUSSÃO……………………………………………………………………………………. 130 7. CONCLUSÃO…………………………………………………………………………………… 145 8. PERSPECTIVAS……………………………………………………………………………….. 146 9. REFERÊNCIAS…………………………………….…………………………………………… 147 31 1. INTRODUÇÃO As doenças cardiovasculares são uma das principais causas de mortalidade global, sendo responsáveis por quase um terço de todas as mortes em 2019, das quais 49,2% foram atribuídas à doença cardíaca isquêmica (DCI) (MARTIN et al., 2024). A DCI, caracterizada pela obstrução das artérias coronárias no miocárdio, pode se manifestar como angina estável, infarto agudo do miocárdio (IM) e insuficiência cardíaca (IC) de origem isquêmica (ROTH; MENSAH; FUSTER, 2020). Entre essas condições, o IM é particularmente grave, pois é causado pela interrupção súbita do fluxo sanguíneo, levando à isquemia, hipóxia e eventual necrose do tecido miocárdico (OPIE, 2004). Além de danos imediatos, o IM promove alterações estruturais e funcionais no coração, conhecidas como remodelamento cardíaco, que aceleram a progressão da IC, agravando o quadro clínico (ZORNOFF et al., 2009, WEI et al., 2023). A disfunção mitocondrial desempenha um ponto crítico nesse processo, uma vez que as mitocôndrias são essenciais tanto para a produção de energia quanto para o controle do estresse oxidativo. No contexto do IM, essas organelas tornam-se importantes fontes importantes de espécies reativas de oxigênio (ERO) (ANDERSSON et al., 2011a), promovendo desequilíbrio entre a produção de radicais livres e a capacidade antioxidante celular. Esse estresse oxidativo resulta em danos às proteínas, lipídeos e DNA mitocondrial, comprometendo a bioenergética celular e contribuindo para o agravamento do remodelamento cardíaco (DRIDI et al., 2023). Nesse contexto, estratégias terapêuticas que atuem diretamente na mitocôndria têm despertado interesse, sendo a mitoquinona (MitoQ) uma das principais candidatas por sua capacidade antioxidante direcionada. Considerando o papel central das ERO e da disfunção mitocondrial no remodelamento cardíaco precoce pós-IM – caracterizado por intensa resposta inflamatória, degradação da matriz extracelular e alterações em proteínas-chave do acoplamento excitação-contração (VAN DER POL et al., 2019) – torna-se essencial investigar intervenções capazes de mitigar esses danos mitocondriais ainda na fase aguda. Assim, este estudo teve como objetivo avaliar os efeitos do tratamento com MitoQ durante os sete dias iniciais após a indução do IM, com foco na prevenção de alterações bioenergéticas e na preservação da função mitocondrial. A hipótese central 32 é que a administração de MitoQ (100 µM) nesse período seja eficaz para promover maior taxa de respiração mitocondrial e síntese de ATP, contribuindo para limitar os danos induzidos por ERO em um estágio crítico do remodelamento ventricular. Para isso, foram analisadas mitocôndrias cardíacas isoladas de ratos, distinguindo-se as subpopulações mitocondriais interfibrilares (IFM) e subsarcolemais (SSM). Avaliaram-se diversos parâmetros funcionais e estruturais, incluindo conteúdo mitocondrial (via citrato sintase), capacidade de retenção de cálcio, consumo de oxigênio com diferentes substratos, potencial de membrana mitocondrial (ΔΨ m), morfologia mitocondrial, bem como a expressão de proteínas associadas à biogênese mitocondrial (NRF1 e TFAM) e à dinâmica mitocondrial (MFN2). Embora estudos prévios tenham indicado benefícios da mitoquinona em modelos experimentais, como em isquemia-reperfusão, seu impacto específico nas mitocôndrias cardíacas na fase aguda pós IM ainda não está completamente elucidado, justificando a proposta e relevância deste trabalho. 33 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Esta revisão aborda os principais fundamentos que sustentam este estudo, com foco na doença cardíaca isquêmica (DCI) e, em particular, no IM. Serão explorados aspectos fisiopatológicos e as alterações patológicas que culminam no remodelamento cardíaco. Adicionalmente, discutiremos as características estruturais e funcionais das mitocôndrias no tecido cardíaco, evidenciando a relação entre a produção de ATP e a função cardíaca, bem como as alterações mitocondriais resultantes de condições cardíacas. Por fim, será apresentada uma abordagem terapêutica inovadora voltada à proteção e recuperação da função mitocondrial, destacando o uso da mitoquinona. 2.1 Doença Cardíaca Isquêmica: Dados Epidemiológicos e Evolução para IC As doenças cardiovasculares (DCV) permanecem entre as principais causas de mortalidade global (MARTIN et al., 2024). Entre elas, a DCI se destaca como a principal, representando 49,2% dos casos de morte por doenças cardiovasculares (ROTH; MENSAH; FUSTER, 2020). No Brasil, a situação é igualmente preocupante, com as DCV liderando como a principal causa de óbitos, sendo a DCI a condição predominante (OLIVEIRA et al., 2024). Em escala global, a prevalência de DCI é mais elevada em homens (8,7%) do que em mulheres (5,8%) (MARTIN et al.,2024) (Figura 1). Figura 1 Prevalência de Doença Cardíaca Isquêmica na População Global., Acidente vascular cerebral isquêmico (AVCI); Acidente vascular cerebral hemorrágico (AVCH). Fonte: Adaptado de ROTH GA, MENSAH GA, FUSTER V., 2020; MARTIN ET AL., 2024 34 A progressão da DCI para IC é uma das principais causas de morbimortalidade cardiovascular. Essa evolução acarreta um impacto considerável na saúde pública, refletido na piora da qualidade de vida dos pacientes, no aumento das taxas de hospitalização e na necessidade de cuidados médicos constantes. Além disso, contribui para a diminuição da capacidade laboral, perda da autonomia física e redução significativa da expectativa de vida (OLIVEIRA et al., 2024). Esses dados reforçam a urgência no desenvolvimento de estratégias terapêuticas que não apenas previnam, mas também retardem a progressão da DCI para IC, minimizando suas consequências clínicas e socioeconômicas. 2.2 Fatores de Risco da DCI A DCI está associada a uma variedade de fatores de risco, que podem ser classificados como modificáveis e não modificáveis. Os fatores modificáveis, por serem passíveis de intervenção, incluem hipertensão arterial, dislipidemia, diabetes mellitus, obesidade, tabagismo, sedentarismo e padrões alimentares inadequados. Já os fatores não modificáveis dizem respeito a características intrínsecas do indivíduo, como idade avançada, sexo masculino e predisposição genética, os quais aumentam significativamente o risco de desenvolvimento da doença (MARTIN et al.,2024; OLIVEIRA et al., 2024). A interação entre esses fatores contribui para o desenvolvimento da aterosclerose, o principal mecanismo fisiopatológico subjacente à DCI. A aterosclerose é caracterizada pelo acúmulo gradual de lipídeos nas paredes das artérias coronárias e formação de placas ateroscleróticas, que resultam em uma redução progressiva do fluxo sanguíneo para o miocárdio. Esse processo aumenta o risco de eventos cardiovasculares graves, incluindo o IM (ROTH; MENSAH; FUSTER, 2020). 2.3 A Doença Cardíaca Isquêmica (DCI) A DCI está fortemente associada ao processo aterosclerótico e pode se manifestar clinicamente de diversas formas, como angina estável, infarto do miocárdio (IM) e IC de origem isquêmica (ROTH; MENSAH; FUSTER, 2020). O IM é uma das complicações mais graves da DCI e ocorre devido à interrupção súbita do fluxo sanguíneo para o miocárdio. Essa imediata, podem evoluir para necrose do tecido cardíaco (OPIE, 2004). 35 O diagnóstico de IM baseia-se na combinação de achados clínicos, eletrocardiográficos e laboratoriais. Os principais sintomas incluem dor precordial, dispneia e fadiga, frequentemente acompanhados por alterações eletrocardiográficas e elevação da cTn acima do percentil 99 do valor de referência, indicando lesão miocárdica (DEFILIPPIS et al., 2019; THYGESEN et al., 2018). O IM é subdividido em dois tipos principais com base nos achados eletrocardiográficos: IM com elevação do segmento ST (STEMI) e o IM sem elevação do segmento ST (NSTEMI) (THYGESEN et al., 2018). Além disso, a Quarta Definição Universal de IM (UDMI) propõe uma subclassificação do IM em cinco tipos, baseada em critérios clínicos, patológicos e prognósticos. O tipo 1 é atribuído à ruptura ou erosão de uma placa aterosclerótica em pacientes com doença arterial coronariana (DAC). O tipo 2, por sua vez, resulta de uma redução aguda do fluxo sanguíneo para o miocárdio, causada por fatores como espasmo da artéria coronária, disfunção microvascular ou condições sistêmicas, incluindo hipoxemia, anemia e hipotensão. Os tipos 3, 4 e 5 englobam, respectivamente, morte cardíaca súbita sem avaliação de biomarcadores, complicações relacionadas a procedimentos de angioplastia e eventos associados a cirurgia de revascularização (THYGESEN et al., 2018). Entre as consequências do IM, destacam-se alterações importantes no miocárdio, que levam ao processo de remodelamento cardíaco. 2.3.1 O Remodelamento Cardíaco no Contexto do IM e sua Progressão para IC O remodelamento cardíaco refere-se a alterações estruturais e funcionais que ocorrem no miocárdio após o IM. Inicialmente, essas mudanças envolvem mecanismo compensatórios que visam preservar a função cardíaca diante da perda de tecido muscular (ZORNOFF et al., 2009, WEI et al., 2023). Dentre as adaptações ao IM, destaca-se a hipertrofia cardíaca patológica, que difere da hipertrofia fisiológica observada em resposta ao exercício físico, a qual está associada à melhora da função cardíaca. A hipertrofia patológica induzida pelo IM é decorrente de mecanismos compensatórios que frequentemente progridem para descompensação. Essa evolução culmina em disfunção contrátil e IC (ZORNOFF et al., 2009, WEI et al., 2023; ROSCA; HOPPEL, 2013). 36 2.3.1.1 Da Hipertrofia Cardíaca à IC A hipertrofia cardíaca, muitas vezes o ponto inicial dessa progressão, é uma resposta do miocárdio ao estresse mecânico induzido por diferentes fatores. Esses fatores podem ser intrínsecos ou extrínsecos ao coração. Entre os fatores intrínsecos, destaca-se a isquemia, que leva ao remodelamento cardíaco. Já entre os fatores extrínsecos, os mais comuns incluem o aumento da pressão arterial e a sobrecarga de volume, frequentemente associadas à hipertensão e doenças valvulares (ROSCA; HOPPEL, 2013; BENJAMIN et al., 2019; BLACK, 2003). O remodelamento cardíaco envolve mecanismos complexos, incluindo a ativação do sistema β-adrenérgico simpático, do sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA) e do remodelamento da matriz extracelular (MEC). Este último caracteriza-se pela deposição excessiva de colágeno e fibrose em regiões distantes do IM, levando à rigidez ventricular e ao comprometimento da função cardíaca. Alterações estruturais adicionais, como disfunções no manejo do cálcio, alterações de proteínas contráteis e metaloproteases, também contribuem para a progressiva disfunção miofibrilar nos estágios avançados da doença (DANIELS et al., 2007; ZORNOFF et al., 2009; STEFANON et al., 2009; FERNANDES et al., 2015). A sinalização β-adrenérgica simpática desempenha papel central na adaptação do miocárdio ao estresse mecânico, mediada pelos receptores β1 e β2. O receptor β1 aumenta os níveis intracelulares de cálcio e promove hipertrofia cardíaca por meio da via AMP cíclico-proteína quinase A (AMPc-PKA), mas sua ativação crônica está associada a apoptose de cardiomiócitos, fibrose e remodelamento patológico. Por outro lado, o receptor β2 exerce efeito protetor, promovendo a sobrevivência celular por meio da via fosfatidilinositol 3-quinase–proteína quinase B (PI3K-Akt). No entanto, a estimulação sustentada dos receptores β, especialmente do β1, está relacionada à disfunção contrátil e inflamação, conforme descrito em revisão publicada por Rosca; Tandler; Hoppel (2013). Além disso, a sinalização β-adrenérgica aumenta a produção de ERO nas mitocôndrias. Em concentrações fisiológicas, essas moléculas atuam como segundos mensageiros, facilitando o aumento do cálcio intracelular e a contratilidade cardíaca (ANDERSSON et al., 2011b). Contudo, sua produção excessiva pode resultar em 37 disfunção mitocondrial, despolarização de membrana, aumento do estresse oxidativo e apoptose de cardiomiócitos (ROSCA; TANDLER; HOPPEL, 2013). Rosca; Tandler; Hoppel (2013) destacam em sua revisão que o sistema renina angiotensina aldosterona desempenha papel importante no remodelamento cardíaco. A angiotensina II (Ang II), ao se ligar ao receptor de angiotensina-1 (AT1), ativa vias intracelulares, como as proteínas quinases C (PKC) e as proteínas quinases ativadas por mitógeno (MAPKs), que contribuem para a hipertrofia cardíaca. Além disso, a Ang II estimula a produção de ERO, levando a danos oxidativos em proteínas, disfunção mitocondrial e autofagia (DAI et al., 2011). Entre os diversos processos envolvidos no remodelamento cardíaco, as mitocôndrias desempenham papel central. Além de fornecerem energia na forma de ATP, elas também geram ERO, que atuam como mediadores-chave dos efeitos inotrópicos e hipertróficos dos sistemas β-adrenérgico e SRAA (ANDERSSON et al., 2011b; DAI et al., 2011). No entanto, sob condições de estresse metabólico, como no IM, o desequilíbrio entre a produção de ERO e a capacidade antioxidante celular leva a danos oxidativos no DNA mitocondrial, disfunção mitocondrial e redução da biogênese mitocondrial (DAI et al., 2011). A interação entre esses processos contribui para a progressão do remodelamento cardíaco e é determinante na transição do estágio compensado da hipertrofia cardíaca para a IC (ANDERSSON et al., 2011b; ROSCA; TANDLER; HOPPEL, 2013; DRIDI et al., 2023) (Figura 2). 38 Figura 2 Representação esquemática do remodelamento cardíaco mediado por estresse mecânico e resposta neuroendócrina. O aumento da demanda energética cardíaca, associado à ativação do sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA) e da via β-adrenérgica, estimula a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) pelas mitocôndrias. Durante a fase de hipertrofia cardíaca compensada, ocorre um aumento na biogênese mitocondrial que ajuda a manter o débito cardíaco. Entretanto, a ativação sustentada dessas vias leva à disfunção mitocondrial, danos ao DNA mitocondrial (mtDNA) e redução da biogênese mitocondrial, comprometendo a bioenergética e levando à transição para IC. Este processo é marcado por alterações no metabolismo energético, redução da contratilidade e queda do débito cardíaco. Fonte: adaptado de Rosca; Tandler; Hoppel (2013) utilizando BioRender.com A IC ocorre quando o coração é incapaz de manter a perfusão tecidual adequada às demandas metabólicas. Ela pode ser classificada de acordo com a fração de ejeção (FE) do ventrículo esquerdo, sendo denominada IC com fração de ejeção reduzida (ICFEr) quando a FE é ≤ 40 e IC com fração de ejeção preservada (ICFEp) quando a FE é ≥ 50%. Quando a fração de ejeção está entre 41 e 49%, é classificada como FE% levemente reduzida (HEIDENREICH et al., 2022a). Clinicamente, a IC manifesta-se por sintomas como dispneia, fadiga e edema periférico, que reduzem a qualidade de vida dos pacientes. Esses sintomas 39 tornamessencial o manejo clínico adequado, que inclui o uso de medicamentos direcionados à melhora dos sintomas e à interrupção da progressão da doença. Como parte do manejo clínico, diversos medicamentos são utilizados, destacando-se os β- bloqueadores, que modulam a hiperatividade do sistema β-adrenérgico simpático; a hidralasina e os nitratos, que funcionam como vasodilatadores; os inibidores da enzima conversora da angiotensina (IECA) e os bloqueadores do receptor da angiotensina II (BRAs), que agem inibindo o SRAA; e os inibidores do cotransportador sódio-glicose tipo 2 (ISGLT2), que promovem efeitos hemodinâmicos e metabólicos favoráveis (BROWN DA et al., 2017; HEIDENREICH et al., 2022a). Apesar dos benefícios dos medicamentos atualmente disponíveis, muitos deles não abordam diretamente as alterações mitocondriais, que desempenham papel central na progressão da IC (BAYEVA; GHEORGHIADE; ARDEHALI, 2013). Essas alterações são responsáveis por disfunções no fornecimento de energia e na regulação dos processos celulares. Dada a complexidade da IC, é essencial desenvolver terapias inovadoras que protejam o miocárdio contra os efeitos adversos do IM e restaurem a função mitocondrial (BROWN DA et al., 2017) (Figura 3). Figura 3 Terapias atuais para IC. As terapias atuais frequentemente não abordam a disfunção mitocondrial como causa subjacente da progressão para IC. Adenosina trifosfato (ATP); Inibidores da enzima conversora da angiotensina (IECA); Bloqueadores do receptor da angiotensina (BRA); Inibidores do cotransportador sódio- glicose tipo 2 (ISGLT2). Fonte: Adaptado de BROWN DA et al., 2017 40 Dessa forma, é importante compreender o papel das mitocôndrias no metabolismo miocárdico, uma vez que são essenciais no fornecimento de energia e na regulação celular. Alem disso, como as disfunções mitocondriais desempenham papel central na progressão do IM para IC, compreender as alterações estruturais e funcionais que afetam essa organela é crucial para identificar alvos terapêuticos específicos. Por isso, os tópicos seguintes abordarão a estrutura e função das mitocôndrias, bem como suas alterações metabólicas no contexto do IM e da IC, com o objetivo de embasar a investigação do papel da mitoquinona como estratégia terapêutica mitocondrial. 2.4 As Mitocôndrias Cardíacas Devido à relevância das mitocôndrias no contexto da IC, é fundamental explorar a fundo sua estrutura e função. As mitocôndrias, amplamente conhecidas como as “usinas de energia” das células (SIEKEVITZ, 1957), desempenham papel essencial no metabolismo energético celular. Essas organelas apresentam formas variáveis, que podem ser esféricas, cilíndricas ou especializadas, o que favorece a troca de metabólitos entre a mitocôndria e o citosol (PERKINS; FREY, 2000). O número de mitocôndrias varia de acordo com o tipo celular e no tecido cardíaco, elas ocupam mais de um terço do volume dos cardiomiócitos (INGWALL, 2002), refletindo a alta demanda energética do coração. Além disso, as mitocôndrias são responsáveis por consumir mais de 80% do oxigênio que respiramos, utilizando-o para oxidar moléculas ricas em hidrogênio presentes nos alimentos, convertendo-as em ATP, água e dióxido de carbono (CO2). O ATP, conhecido como a “moeda energética” universal, é indispensável para a sobrevivência e funcionamento das células (PERKINS; FREY, 2000). No coração, as mitocôndrias produzem cerca de 95% do ATP celular, sustentando a atividade contrátil contínua e garantindo o funcionamento ininterrupto do órgão (OPIE, 2004). 2.4.1 Aspectos Estruturais e Funcionais da Mitocôndria Cardíaca Além de sua variabilidade morfológica, as mitocôndrias possuem uma organização funcional intrínseca que reflete suas múltiplas funções metabólicas. George Palade, 41 em 1953, utilizando a microscopia eletrônica, descreveu detalhadamente a estrutura interna das mitocôndrias (PALADE, 1953). A Figura 4 ilustra sua organização estrutural geral, que inclui duas membranas (interna e externa), o espaço intermembrana e a matriz mitocondrial, demonstrando como sua arquitetura é diretamente relacionada às suas funções metabólicas. Além disso, a mitocôndria apresenta dimensões estimadas de 1 a 2µm de comprimento e 0,1 a 0,5 µm de largura (PERKINS; FREY, 2000). Figura 4 Estrutura Geral da Mitocôndria. Fonte: adaptado de Perkins; Frey, 2000, utilizando BioRender.com. As mitocôndrias possuem duas membranas distintas: a membrana mitocondrial externa (MME) e a membrana mitocondrial interna (MMI). A MME é relativamente permeável a íons e pequenas moléculas, devido à presença do canal aniônico dependente de voltagem (VDAC). O VDAC, também conhecido como porina mitocondrial, atua como um ponto de troca de metabólitos entre as mitocôndrias e o citosol, além de participar do processo de apoptose mitocondrial (SHOSHAN- BARMATZ; BEN-HAIL, 2012). Em contraste, a MMI é altamente seletiva, sendo impermeável à maioria das moléculas pequenas e íons, incluindo o próton (H+), cuja impermeabilidade é essencial 42 para a manutenção do gradiente eletroquímico necessário à produção de ATP (KENNEDY EP; LEHNINGER AL, 1948; NELSON; COX, 2022). A membrana interna forma invaginações conhecidas como cristas mitocondriais, que aumentam a área de superfície disponível para os processos metabólicos, como a fosforilação oxidativa (PALADE, 1953) e abrigam componentes fundamentais, como os complexos de I a IV da cadeia transportadora de elétrons (CTE) e o complexo V (FoF1-ATP sintase ou simplesmente ATP sintase), essenciais para a produção de energia (PERKINS; FREY, 2000) (Figura 5). Figura 5 Componentes estruturais e funcionais da mitocôndria cardíaca (vide explicação no texto). Canal aniônico dependente de voltagem (VDAC); transportador de nucleotídeo de adenina (ANT); transportador de fosfato (PiC); creatina quinase (CK); fosfato inorgânico (Pi); creatina (Cr); proteína desacopladora (UCP); citocromo c (Cyt c); coenzima Q (CoQ). Fonte: Adaptado de OPIE H. L., 2004 utilizando BioRender.com. A FoF1-ATP sintase é fundamental para o metabolismo energético, sendo formada por diversas subunidades organizadas em duas regiões principais: a porção catalítica (F1 ), na matriz mitocondrial, e a porção membranosa (Fo), inserida na MMI, sendo ambas conectadas por hastes centrais e periféricas. A Fo atua como um canal transmembrana para o fluxo de prótons gerado pelo gradiente eletroquímico da CTE. Esse fluxo gera a força motriz necessária para induzir a rotação da Fo, que permite à 43 F 1 catalisar a síntese de ATP a partir de ADP (adenosina difosfato) e fosfato inorgânico (Pi) (SENIOR; NADANACIVA; WEBER, 2002). Nessa estrutura, destaca- se a subunidade proteica conferente de sensibilidade à oligomicina (OSCP), que interage com a Ciclofilina D no complexo ATP sintase, com funções estabilizadoras e regulatórias (GIORGIO et al., 2013), temas explorados a seguir. Além dos complexos da CTE, a MMI contém transportadores fundamentais para a síntese de ATP. O transportador de nucleotídeo de adenina (ANT) é responsável por permitir a troca de ADP para dentro e ATP para fora da matriz mitocondrial, e o transportador de fosfato (PiC) é essencial para a entrada de fosfato na matriz, um componente necessário para a síntese de ATP. Durante a fosforilação oxidativa, o espaço intermembrana acumula prótons, um processo crítico para o funcionamento eficiente da cadeia respiratória (KENNEDY EP; LEHNINGER AL, 1948; NELSON; COX, 2022) (Figura 5). Além de a MMI ser o principal local de produção de ATP por fosforilação oxidativa, a matriz mitocondrial abriga processos metabólicos essenciais, como o ciclo do ácido cítrico (CAC), a β-oxidação dos ácidos graxos e a oxidação dos aminoácidos (KENNEDY; LEHNINGER, 1949). Adicionalmente, Logan (2006) descreve em sua revisão que a matriz mitocondrial contém o DNA mitocondrial e um maquinário independente para a síntese de proteínas, representado pelos ribossomos mitocondriais. Entretanto, a maior parte das proteínas mitocondriais é codificada pelo genoma nuclear, sintetizada no citosol e, posteriormente, transportada para o interior das mitocôndrias. Essa integração estrutural sustenta as funções metabólicas das mitocôndrias, que adaptam seu funcionamento às demandas metabólicas do coração. 2.4.2 Funções Metabólicas e Regulação As mitocôndrias cardíacas possuem alta flexibilidade metabólica, adaptando seu funcionamento de acordo com a disponibilidade de substratos e as necessidades metabólicas (OPIE, 2004). Em condições normais, quando há suprimento adequado de oxigênio, o coração adulto utiliza preferencialmente ácidos graxos como principal fonte energética. Estima-se que entre 60 e 90% da produção de acetil-CoA, essencial para o ciclo energético, seja derivada da β-oxidação de ácidos graxos, enquanto 10 a 44 40% provêm de outras fontes, como glicose, lactato, aminoácidos e corpos cetônicos (OPIE, 2004; BUGGER; PFEIL, 2020). No miocárdio fetal, por outro lado, a glicose é o principal substrato energético. Após o nascimento, ocorre uma intensa reorganização do metabolismo cardíaco, incluindo aumento na biogênese mitocondrial, que prepara o coração para utilizar predominantemente ácidos graxos como fonte de energia. Essa transição reduz a dependência de glicose, tornando a β-oxidação o principal processo metabólico no coração adulto (GIRARD; FERRFI; PFIGORIER, 1992; OPIE, 2004). A β-oxidação ocorre na matriz mitocondrial e depende da enzima carnitina palmitoiltransferase (CPT-I), que transporta ácidos graxos do citosol para dentro da mitocôndria. Uma vez dentro, os ácidos graxos são metabolizados em moléculas menores, como acetil-CoA, NADH e FADH2. Esses produtos alimentam o CAC e a CTE, processos essenciais para a produção de ATP (KERNER; HOPPEL, 2000; BUGGER; PFEIL, 2020; VARGA; CZIMMERER; NAGY, 2011) (Figura 6). Figura 6 Metabolismo Mitocondrial Cardíaco. A figura ilustra a glicólise, a β-oxidação e os principais transportadores e enzimas do metabolismo cardíaco, incluindo: enzima carnitina palmitoiltransferase I (CPT-I, transporte de ácidos graxos); transporte de glicose (GLUT); transportador de lactato (MCT1); piruvato desidrogenase (PDH, metabolismo de carboidratos). Fonte: Adaptado de Stanley, W.C.,2005 utilizando BioRender.com. 45 Outro processo importante para a síntese de ATP é a glicólise, que ocorre no citosol. Nesse processo, a glicose entra no cardiomiócito através de transportadores específicos, como o GLUT-1 e o GLUT- 4, sendo o GLUT- 4 ativado por estímulos como insulina, exercício físico ou isquemia, enquanto o GLUT-1 mantém um transporte basal de glicose (YOUNG; COVEN; RUSSELL, 2000). No citosol, a glicose é degradada em moléculas menores, gerando piruvato, ATP e NADH. Em condições normais, com oferta suficiente de oxigênio, o piruvato é transportado para a matriz mitocondrial, onde participa do CAC, contribuindo para a produção de mais ATP (Figura 6). No entanto, em condições de hipoxemia, o piruvato é convertido em lactato por meio de uma via anaeróbica, que mantém a produção de energia mesmo em situações adversas (OPIE; OWEN; RIEMERSMA, 1973; GOODWIN; TAYLOR; TAEGTMEYER, 1998). A glicólise no miocárdio é regulada por três enzimas principais: fosfofrutoquinase-1 (PFK-1), fosfofrutoquinase-2 (PFK-2) e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH). A PFK-1 é considerada o principal ponto de controle da via glicolítica, sendo inibida por altos níveis de ATP/ADP, citrato e acidose tecidual, o que limita o fluxo glicolítico. Já a PFK-2 exerce papel estimulador sobre a PFK-1, especialmente em condições de isquemia, ao produzir frutose-2,6- bifosfato, que potencializa a glicólise (OPIE, Lionel H., 2004). A GAPDH, por sua vez, tem sua atividade inibida pelo acúmulo de NADH, reduzindo o fluxo glicolítico em situações em que a CTE está comprometida (STANLEY; RECCHIA; LOPASCHUK, 2005b) (Figura 6). Após a glicólise, o piruvato gerado no citosol é convertido na mitocôndria em acetil- CoA e NADH pela ação da piruvato desidrogenase (PDH), que conecta a glicólise ao CAC e à fosforilação oxidativa (OPIE, 2004). A atividade da PDH é regulada pelo estado energético celular, sendo inibida pela PDH quinase (PDK), que responde a condições como aumento da relação NADH/NAD+, hipóxia, isquemia ou aumento da oxidação de ácidos graxos. Nessas situações, a PDK reduz a oxidação do piruvato, desacoplando a glicólise do CAC. O NADH gerado durante a glicólise transfere seus equivalentes redutores para o interior da mitocôndria pela lançadeira malato-aspartato (OPIE, 2004; RANDLE et al., 1963; NUUTILA et al., 1992). 46 2.4.3 A Lançadeira Malato-Aspartato A lançadeira malato-aspartato é um sistema bioquímico essencial que liga a glicólise citosólica ao CAC. Esse mecanismo permite o transporte indireto de equivalentes redutores, como o NADH gerado no citosol, para a mitocôndria, uma vez que a MMI não é permeável ao NADH. De forma simplificada, o sistema funciona convertendo o oxaloacetato em malato no citosol, utilizando o NADH. O malato atravessa a MMI por meio de transportadores específicos, e no interior da mitocôndria, é reconvertido em oxaloacetato, regenerando o NADH, que será utilizado na CTE para a produção de ATP (OPIE, 2004) (Figura 7). Figura 7 A lançadeira malato-aspartato é essencial para transferir prótons do NADH citosólico para a mitocôndria. Seu funcionamento é reduzido ou interrompido no coração em condições de isquemia ou de IC. Fonte: Adaptado de OPIE (2004) utilizando BioRender.com. Entretanto, em condições de baixo teor de oxigênio, como isquemia e IC, a atividade da lançadeira é inibida, levando ao acúmulo de NADH no citosol e à formação de lactato, o que causa acidose tecidual. Esse desequilíbrio inibe a PDH, limitando a entrada do piruvato no CAC. Além disso, a fosforilação oxidativa prejudicada promove um aumento da relação NADH/NAD+ na mitocôndria, o que inibe as desidrogenases do CAC e agrava a disfunção metabólica (OPIE, 2004). Essa disfunção destaca a importância do CAC, um dos processos metabólicos centrais da mitocôndria, cuja eficiência é essencial para sustentar a produção de energia em condições normais. 47 2.4.4 O Ciclo do Ácido Cítrico O ciclo do ácido cítrico (CAC), também conhecido como Ciclo do Ácido Tricarboxílico ou Ciclo de Krebs, é uma via metabólica central que ocorre na matriz mitocondrial, funcionando apenas em condições aeróbicas. Ele é o principal responsável pela oxidação do acetil-CoA a CO2, utilizando como substratos moléculas provenientes da metabolização de glicose e ácidos graxos. O processo começa com a entrada do acetil-CoA no CAC, onde se combina com oxaloacetato (OAA) para formar citrato, por meio da ação da enzima citrato sintase, considerada um marcador clássico da atividade mitocondrial. A partir desse ponto, o ciclo envolve uma série de reações que geram os equivalentes redutores NADH e FADH2, os quais são posteriormente utilizados na CTE para a produção de ATP. Conforme descrito na revisão de Akram (2014), esse ciclo desempenha um papel essencial na bioenergética celular e na manutenção da homeostase metabólica (vide Figura 6 e Figura 7). Além dos substratos tradicionais, como acetil-CoA, o CAC é continuamente reabastecido por substratos anapleróticos, como piruvato, aspartato e glutamato. Esses substratos repõem os intermediários do ciclo em momentos de alta demanda metabólica, como no aumento da atividade cardíaca. No coração saudável, a anaplerose assegura a eficiência do CAC, permitindo a produção contínua de energia para sustentar as funções contráteis e metabólicas do coração (ALHASAN et al., 2024; GIBALA; YOUNG; TAEGTMEYER, 2000). Além de sua função na geração de ATP, o CAC também é fundamental para a produção de intermediários metabólicos, que são exportados da mitocôndria para participação em outras vias metabólicas, processo conhecido como cataplerose. Segundo revisão de Alhasan et al. (2024),o equilíbrio entre anaplerose (reabastecimento de intermediários) e cataplerose (remoção de intermediários para outras vias) é crucial para a manutenção da homeostase metabólica. Nesse contexto, a lançadeira malato-aspartato desempenha papel fundamental na manutenção desse equilíbrio, permitindo a comunicação eficiente entre o CAC e outras vias metabólicas. Essa lançadeira conecta o CAC às vias de biossíntese e garante o transporte eficiente de equivalentes redutores, como o NADH, entre o citosol e a mitocôndria. Dessa forma, ela contribui para equilíbrio redox e sustenta a produção de energia. No entanto, em condições patológicas, como a IC, alterações nesse 48 mecanismo foram observadas, incluindo o comprometimento do transporte de intermediários e o desequilíbrio entre anaplerose e cataplerose. Essas disfunções estão associadas tanto ao desenvolvimento quanto ao agravamento da IC, exacerbando a disfunção metabólica, como amplamente discutido na revisão de ALHASAN et al. (2024). Assim, uma integração eficiente entre a glicólise e o CAC é fundamental para alimentar a fosforilação oxidativa, processo central para a produção de ATP no coração. 2.4.5 A fosforilação oxidativa e a Taxa de Controle Respiratório A fosforilação oxidativa é o principal mecanismo de geração de energia no coração, sendo essencial para atender as altas demandas energéticas desse órgão. Esse processo ocorre na mitocôndria, especificamente na CTE, que utiliza os equivalentes redutores NADH e FADH2, gerados no CAC, para a síntese de ATP (STANLEY; RECCHIA; LOPASCHUK, 2005b). O processo tem início no complexo I, onde os elétrons provenientes do NADH são transferidos para a coenzima Q (ubiquinona). Paralelamente, no complexo II, os elétrons do FADH2 seguem o mesmo percurso. A coenzima Q, uma molécula lipossolúvel inserida na MMI, transporta esses elétrons ao complexo III, que os transfere ao citocromo c. Finalmente, no complexo IV, os elétrons são conduzidos ao oxigênio, resultando na formação de água (H2O) como produto final (MITCHELL, 1961; BUGGER; PFEIL, 2020). Para otimizar esse processo, os complexos I, III e IV organizam-se em supercomplexos, que também minimizam a produção de ERO, como o superóxido (SCHÄGGER; PFEIFFER, 2000). Durante o transporte de elétrons, prótons são bombeados da matriz mitocondrial para o espaço intermembrana, gerando um gradiente eletroquímico conhecido como força próton-motriz. Esse gradiente é crucial para a síntese de ATP pela ATP sintase, que utiliza a energia do retorno dos prótons à matriz mitocondrial para converter ADP em ATP (MITCHELL, 1961; STANLEY; RECCHIA; LOPASCHUK, 2005; OPIE, 2004). Além disso, o potencial de membrana negativo gerado pelo transporte de prótons facilita a entrada de íons cálcio na matriz mitocondrial, que desempenham papel fundamental na regulação metabólica e na sinalização celular (WILLIAMS; BOYMAN; LEDERER, 2014). 49 A coenzima Q (ubiquinona) atua não apenas no transporte de elétrons, mas também no acoplamento do fluxo de elétrons ao transporte de prótons através da MMI. Ela pode aceitar um ou dois elétrons, sendo convertida em ubisemiquinona (radical QH ) ou ubiquinol (QH2), respectivamente. Contudo, na forma intermediária de ubisemiquinona, a coenzima Q pode gerar radicais superóxidos em condições adversas, contribuindo para o estresse oxidativo (JAMES; SMITH; MURPHY, 2004). A eficiência da fosforilação oxidativa varia de acordo com o substrato oxidado, refletida na relação fósforo/oxigênio (P/O). Para cada ½ O2 reduzido a H2O, a proporção de ATP gerado é de aproximadamente 2,5 quando os elétrons entram pelo complexo I e de 1,5 pelo complexo II (HINKLE, 2005). Por exemplo, na oxidação completa de uma molécula de glicose até CO2, são geradas entre 30 e 32 moléculas de ATP, consumindo 12 átomos de oxigênio, o que resulta em uma relação P/O de 2,5. Por outro lado, na oxidação de uma molécula de palmitato, consomem-se 46 átomos de oxigênio para a produção de 108 moléculas de ATP, resultando em uma relação P/O de 2,35 (OPIE, 2004; HONKA et al., 2021). Essa diferença ilustra que, em situações de hipóxia, a preferência por glicose como substrato pode otimizar o consumo de oxigênio, uma adaptação crítica para o miocárdio (INGWALL, 2002). No coração saudável, o pool de ATP é continuamente renovado, mantendo o equilíbrio entre a oxidação de substratos, a redução de NADH/FADH2, o transporte de elétrons na CTE, o consumo de oxigênio e a síntese e hidrólise do ATP necessário para o trabalho cardíaco (STANLEY; RECCHIA; LOPASCHUK, 2005) (Figura 8). Fatores como o fornecimento de ADP, a relação NADH/NAD+ na mitocôndria e a concentração de cálcio mitocondrial são cruciais para regular a taxa respiratória (OPIE, Lionel H., 2004). Contudo, na IC, esse equilíbrio é comprometido, resultando em um suprimento energético insuficiente para atender às demandas do coração (STANLEY; RECCHIA; LOPASCHUK, 2005b; BROWN, D. A. et al., 2017). 50 Figura 8. Inter-relação entre a oxidação de substratos, a redução de NAD+/FAD+ no ciclo do ácido cítrico, o transporte de elétrons na cadeia transportadora de elétrons, e a síntese e hidrólise de ATP. Nicotinamida adenina dinucleotídeo oxidado (NAD+); nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido (NADH); adenosina trifosfato (ATP); adenosina difosfato (ADP); fosfato inorgânico (Pi). Fonte: Adaptado de Stanley; Recchia; Lopaschuk, (2005). Outro sistema importante na manutenção da energia cardíaca é o sistema da fosfocreatina (PCr). Inicialmente, o ATP atravessa a MMI pelo transportador de nucleotídeo de adenina (ANT). Em seguida, a energia armazenada no ATP é transferida para o pool de PCr por meio da ação da creatina quinase (CK) mitocondrial (CKmt). A PCr é um composto altamente difusível que atua como um reservatório energético e facilita o transporte de energia para locais de alta demanda metabólica, como as miofibrilas (CARLEY; TAEGTMEYER; LEWANDOWSKI, 2014a) (Figura 9). Figura 9 Sistema de transferência de energia no coração (detalhes no texto). A fosfocreatina (PCr) atua como um meio eficiente de transmissão de energia para locais periféricos de utilização de ATP. A linha vermelha tracejada indica uma via alternativa de transferência de ATP menos provável, já que a difusão do ATP diretamente é limitada. Fonte: adaptado de CARLEY; TAEGTMEYER; LEWANDOWSKI (2014), utilizando BioRender.com. 51 No citoplasma, a PCr é reconvertida em creatina livre pela CK citoplasmática, liberando energia que é utilizada para a síntese de ATP local. Essa energia é então consumida pelas ATPases periféricas. Como a difusão direta do ATP é limitada, a proximidade física entre a mitocôndria e os locais de utilização de energia é essencial para a eficiência metabólica (CARLEY; TAEGTMEYER; LEWANDOWSKI, 2014a) Na IC, entretanto, esse sistema encontra-se comprometido, levando a uma redução na relação fosfocreatina/ATP, um importante preditor de mortalidade cardiovascular (NEUBAUER et al., 1997). Diante do grave comprometimento energético observado na IC, torna-se imprescindível compreender a importância do ATP na manutenção da função cardíaca e na regulação da homeostase celular, elementos essenciais para a viabilidade do miocárdio. 2.4.5.1 A Importância do ATP na Célula Cardíaca Como discutido até aqui, o ATP é a principal fonte de energia para a manutenção da função cardíaca, sustentando processos metabólicos indispensáveis no ciclo de contração e relaxamento do miocárdio. Além de fornecer energia, o ATP participa da regulação da homeostase do cálcio intracelular, elemento essencial para o equilíbrio eletrofisiológico e a funcionalidade do coração. Entre suas principais funções na célula cardíaca, destaca-se o suporte ao funcionamento das bombas iônicas e das proteínas contráteis, garantindo a eficiência da atividade cardíaca e a resposta adequada às demandas metabólicas (BERS, 2002; WANG, K. et al., 2018). A cálcio - ATPase do retículo sarcoplasmático (SERCA 2a) é um dos principais consumidores de ATP no cardiomiócito. Durante o relaxamento muscular, ela promove a recaptura ativa de cálcio para o interior do reticulo sarcoplasmático. Esse processo reduz sua concentração no citoplasma, permitindo a dissociação do cálcio da troponina C. Essa ação é indispensável para restaurar o estado de repouso celular e preparar o miocárdio para o próximo ciclo contrátil (BERS, 2002) (Figura 10). 52 Figura 10 Transporte de cálcio e importância do ATP na célula cardíaca. A figura ilustra os principais mecanismos de transporte de cálcio e o papel do ATP na manutenção da função cardíaca (vide explicação no texto). Fonte: Adaptado de BERS, (2002);utilizando BioRender.com. A Na+/K+ ATPase utiliza ATP para manter o gradiente eletroquímico essencial ao transporte de íons e ao equilíbrio osmótico, restaurando a polaridade da membrana após cada ciclo contrátil. Além disso, essa enzima influencia a remoção de cálcio (Ca2+) intracelular pelo trocador Na+/Ca2+ (NCX). um mecanismo fundamental para a homeostase do cálcio. Adicionalmente, a cálcio - ATPase da membrana plasmática (PMCA) transporta cálcio para fora da célula, regulando seus níveis intracelulares e prevenindo sobrecargas que possam comprometer a função cardíaca (BERS, 2002; OPIE, 2004) (Figura 10). Além de regular os níveis intracelulares de cálcio, o uniporter de cálcio mitocondrial (MCU) transporta cálcio para o interior da mitocôndria, conectando o metabolismo energético ao estado contrátil do coração. Embora esse processo não dependa diretamente de ATP, ele é guiado pelo gradiente eletroquímico gerado pela CTE, destacando a importância dessa regulação metabólica (BERS, 2002; OPIE, 2004). 53 Além das bombas iônicas, a energia fornecida pelo ATP também é indispensável para o funcionamento das proteínas contráteis do miocárdio. Ela viabiliza o deslizamento entre actina e miosina, permitindo tanto a contração quanto o relaxamento muscular. Durante o relaxamento, a redução dos níveis de ATP impede a dissociação entre essas proteínas, resultando em rigidez muscular. Esse mecanismo contribui para as anormalidades na função cardíaca observadas em condições como hipertrofia e IC (KATZ, 1993) (Figura 11). Figura 11 O duplo papel do ATP na contratilidade e relaxamento – O ATP fornece energia essencial para o deslizamento entre actina e miosina, permitindo tanto a contração quanto o relaxamento muscular. Na ausência ou redução de ATP, o músculo entra em um estado de rigidez durante a fase de relaxamento. Fonte: Adaptado de Katz AM, 1993 utilizando BioRender.com. 2.4.6 As Subpopulações Mitocondriais Além do papel no suporte energético direto ao ciclo contrátil, as mitocôndrias cardíacas se destacam também por sua localização estratégica. Essa disposição espacial garante um suprimento energético eficiente para processos essenciais, como a contração muscular e a regulação da homeostase do cálcio, devido à sua proximidade com estruturas-chave, como o RS, as miofibrilas e o sarcolema. Estudos pioneiros realizados por Palmer; Tandler Hoppel (1977) demonstraram a existência de duas subpopulações mitocondriais cardíacas com diferentes características funcionais e localizações específicas: as mitocôndrias subsarcolemais(SSM), localizadas abaixo do sarcolema, e as mitocôndrias interfibrilares (IFM), situadas entre as miofibrilas (PALMER; TANDLER; HOPPEL, 1977; HOLMUHAMEDOV, et al., 2012) (Figura 12). Uma terceira subpopulação foi identificada na região perinuclear (HOLLANDER; THAPA; SHEPHERD, 2014), 54 reforçando a relação direta entre a localização mitocondrial e as demandas energéticas das diferentes regiões do cardiomiócito. Figura 12 Subpopulações Mitocondriais Cardíacas. As mitocôndrias subsarcolemais (SSM) estão localizadas abaixo do sarcolema, enquanto as mitocôndrias interfibrilares (IFM) estão distribuídas entre as miofibrilas, com funções adaptadas às suas localizações específicas. Fonte: HOLMUHAMEDOV EL, et al., 2012 A subpopulação IFM apresenta taxas de oxidação de substratos de 1.4 a 1.7 vezes mais rápidas do que as observadas nas SSM, além de maior atividade de enzimas, como a glutamato desidrogenase, succinato desidrogenase e citrato sintase (PALMER; TANDLER; HOPPEL, 1977a). Essas diferenças funcionais refletem a maior capacidade oxidativa das IFM para atender às altas demandas metabólicas durante os processos de contração e relaxamento muscular. Por outro lado, as SSM fornecem ATP para sustentar o funcionamento das bombas iônicas na membrana plasmática, como a Na+/K+ - ATPase e as bombas de cálcio. Contudo, em comparação com as IFM, a produção de ATP pelas SSM ocorre de forma mais lenta, com um tempo maior para a conversão de ADP em ATP (HOLMUHAMEDOV et al., 2012). Além disso, as SSM são mais suscetíveis a danos em condições de isquemia, devido à sua localização e menor capacidade oxidativa, o que pode comprometer o fornecimento energético local e exacerbar disfunções celulares (HOLMUHAMEDOV et al., 2012; PALMER; TANDLER; HOPPEL, 1986a). Dentre essas subpopulações, as IFM se destacam por sua localização estratégica entre as miofibrilas, permitindo papel essencial na ciclagem de cálcio mitocondrial e na manutenção da função contrátil, como será abordado a seguir. 55 2.4.6.1 Papel das IFM na Ciclagem do Cálcio As IFM, estrategicamente localizadas entre as miofibrilas e próximas às junções do RS juncional, realizam a ciclagem mitocondrial de cálcio. Essa proximidade facilita a comunicação direta com os microdomínios de cálcio, promovendo a síntese de ATP necessária para sustentar a função contrátil e o bombeamento de cálcio mediado pela SERCA2a (Figura 13). A eficiente ciclagem de cálcio é importante para sincronizar os processos de geração de energia mitocondrial e a demanda contrátil do coração, conforme revisado por Lukyanenko; Chikando; Lederer (2009). Figura 13 Esquema das subpopulações mitocondriais cardíacas. As IFM estão localizadas entre as linhas Z e próximas ao RS juncional (RSj), enquanto as SSM estão posicionadas sob o sarcolema, onde fornecem energia para os processos metabólicos relacionados ao transporte de íons na membrana plasmática. As mitocôndrias perinucleares foram omitidas para simplificação do esquema. Receptores de rianodina (RYR2); ATPase de cálcio do RS (SERCA2a). Fonte: desenho de autoria própria baseado em Holmuhamedov et al. (2012) e na revisão de Lukyanenko; Chikando; Lederer (2009). Em condições patológicas, como IC ou isquemia, as IFM podem perder essa conexão funcional com o RS juncional devido a uma desproporção de miofibrilas e mitocôndrias e ao aumento de tecido conjuntivo, levando a disfunções metabólicas e contráteis (SU; SEKIGUCHI; ENDO, 2000; LUKYANENKO; CHIKANDO; LEDERER, (2009). 56 2.4.7 Metabolismo do Cálcio Mitocondrial. Após compreender a localização estratégica das subpopulações mitocondriais, passamos agora a explorar o papel do cálcio mitocondrial como um elo fundamental entre as demandas energéticas e a geração de energia. As mitocôndrias estão intimamente associadas com os receptores de rianodina (RyR2) no RS, formando microdomínios ricos em cálcio. Nesse contexto, a proteína mitofusina-2 (Mfn2) realiza a comunicação funcional entre as mitocôndrias e o RS (CARLEY; TAEGTMEYER; LEWANDOWSKI, 2014b). O cálcio liberado pelos RyR2 entra nas mitocôndrias por canais especializados, como o canal de ânions dependente de voltagem (VDAC), localizado na MME, e o MCU, situado na MMI. Esse transporte é fundamental para a ativação de enzimas como a piruvato desidrogenase (PDH), isocitrato desidrogenase (ICDH) e α-cetoglutarato desidrogenase (α-KDH), que desempenham papeis fundamentais na produção de NADH e na geração de ATP pela CTE (Figura 14). Figura 14 O cálcio mitocondrial e sua regulação do metabolismo energético. O aumento do cálcio modula a atividade de enzimas-chave, como a piruvato desidrogenase (PDH), isocitrato desidrogenase (ICDH) e α-cetoglutarato desidrogenase (α-KDH). Fonte: Adaptado de CARLEY AN, TAEGTMEYER H, LEWANDOWSKI ED. (2014), utilizando BioRender.com. 57 O MCU é uma estrutura multiproteica responsável pelo transporte seletivo de cá para a matriz mitocondrial. Ele formado por uma subunidade central que forma o poro do canal, pela sua isoforma dominante negativa (MCUb) e pelo regulador essencial do MCU (EMRE), que permite sua interação com as subunidades reguladoras de captação de cálcio. Esses reguladores (MICU1, MICU2 e MICU3) localizam-se no espaço intermembrana e são responsáveis por detectar aumentos na concentração de cálcio citosólico, modular a abertura do MCU e regular sua tolerância ao cálcio (D’ANGELO; RIZZUTO, 2023). A remoção de cálcio da matriz mitocondrial é importante para a homeostase celular e ocorre, principalmente, pelo trocador Na +/Ca2+ (NCLX), cuja atividade é regulada pelas concentrações intracelulares de Na+ e pelo pH (CROMPTON; KÜNZI; CARAFOLI, 1977). Outros mecanismos incluem o trocador H+/Ca2+ (TSAI et al., 2014) e o poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP) (HAWORTH; HUNTER, 1979). Os níveis de cálcio mitocondrial aumentam em reposta ao incremento das concentrações de cálcio citoplasmático, especialmente em situações de alta demanda energética (DENTON; MCCORMACK, 1980). Esse aumento estimula o metabolismo de substratos como o piruvato e os ácidos graxos acil-Co-A, intensificando a produção de NADH e ATP (CARLEY; TAEGTMEYER; LEWANDOWSKI, 2014a). Evidências também indicam que o cálcio intramitocondrial pode estimular diretamente a ATP sintase e o complexo III da CTE, amplificando ainda mais a produção de ATP (GLANCY; BALABAN, 2012) (Figura 14). Assim, o cálcio mitocondrial é importante na regulação do metabolismo energético, modulando diretamente a produção de ATP e influenciando os processos metabólicos que sustentam a demanda celular. 2.4.8 Espécies Reativas de Oxigênio (ERO) na Mitocôndria Cardíaca O aumento da atividade metabólica mitocondrial, especialmente em condições de alta demanda energética, está frequentemente associado à maior produção de ERO. Essas moléculas são subprodutos naturais do metabolismo aeróbico e desempenham um papel fundamental na homeostase mitocondrial. Em concentrações reduzidas, as ERO mitocondriais atuam como mediadores essenciais em diversas vias de 58 sinalização celular. No entanto, quando em excesso, podem causar danos oxidativos a proteínas, lipídios e DNA, comprometendo a integridade celular (BUGGER; PFEIL, 2020). Além disso, o aumento do estresse oxidativo mitocondrial pode comprometer a síntese de ATP e aumentar a probabilidade de morte celular, contribuindo para disfunções metabólicas graves (WALLACE; FAN; PROCACCIO, 2010; MURPHY, 2009). As ERO incluem tanto radicais livres e quanto moléculas não radicais, ambas capazes de interagir com biomoléculas e modular processos celulares. Entre os radicais livres, destacam-se o radical livre superóxido (O2 −), gerado principalmente pelos complexos I e III da CTE, e o radical hidroxila ( OH), um dos oxidantes mais potentes conhecidos. Entre as moléculas não radicais, o peróxido de hidrogênio (H2O2) se destaca por sua capacidade de difusão e participação em vias de sinalização celular. O H2O2 pode ser convertido em água pela ação da catalase ou participar da reação de Fenton, na qual reage com o íon ferroso (Fe2+), resultando na formação do radical hidroxila ( OH), um agente altamente citotóxico. O superóxido, por sua vez, pode reagir com óxido nítrico (NO) para formar peroxinitrito (ONOO-), uma molécula altamente reativa e potencialmente danosa (BUGGER; PFEIL, 2020) (Figura 15). Figura 15 Fontes de espécies reativas de oxigênio mitocondriais (ERO) Fonte: Adaptado de BUGGER; PFEIL (2020) utilizando BioRender.com. 59 Quando as mitocôndrias não estão produzindo ATP, seja pela falta de oxigênio ou pelo aumento da razão NADH/NAD+, ocorre maior formação de ERO, especialmente radicais superóxidos (O2 −). Esse fenômeno está associado ao aumento da força próton-motriz devido à menor utilização de prótons na síntese de ATP, além da redução no pool de coenzima Q na MMI (MURPHY, M. P., 2009). O acúmulo excessivo de ERO e cálcio, associado ao desequilíbrio energético mitocondrial, modula a abertura do mPTP, um mecanismo essencial para a regulação da sobrevivência celular e um ponto de convergência entre o metabolismo energético e a resposta ao estresse. 2.4.9. O Poro de Transição de Permeabilidade Mitocondrial (mPTP) Além da sua atuação na regulação do metabolismo energético mitocondrial, como discutido anteriormente, o cálcio também está intimamente relacionado à modulação do mPTP, que regula processos metabólicos sob condições fisiológicas. No entanto, em situações de estresse, o mPTP pode induzir disfunções metabólicas e morte celular. A compreensão de sua estrutura e funcionamento é, portanto, indispensável para o estudo dos mecanismos de homeostase mitocondrial. 2.4.9.1 Estrutura e Funcionamento O mPTP é uma estrutura não seletiva localizada na MMI, permitindo a passagem súbita de solutos de até 1,5 kDa (HAWORTH; HUNTER, 1979). Embora sua composição exata ainda não esteja completamente elucidada, modelos sugerem que ele pode ser formado por alterações na ATP sintase induzidas pelo cálcio, for