UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO - UFES
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E ENGENHARIAS - CCAE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA - PPGAG
YANIRA LIZZETH LIMÓN CARRIÓN
ISOLAMENTO, BIOLOGIA E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE
BACTERIÓFAGOS PARA O MANEJO DA MURCHA-BACTERIANA DO
TOMATEIRO
ALEGRE – ES
2022
YANIRA LIZZETH LIMÓN CARRIÓN
ISOLAMENTO, BIOLOGIA E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE
BACTERIÓFAGOS PARA O MANEJO DA MURCHA-BACTERIANA DO
TOMATEIRO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Agronomia- PPGAG, do Centro de
Ciências Agrárias e Engenharias da Universidade
Federal do Espírito Santo, como parte das exigências
para obtenção do Título de Mestre em Agronomia,
na área de concentração Produção Vegetal, Linha de
Pesquisa Proteção Sustentável de Plantas
(Fitopatologia).
Orientador: Prof. Dr. André da Silva Xavier
Coorientadores: Prof. Dr. Willian Bucker Moraes
Dra. Fernanda Pereira da Silva
ALEGRE – ES
2022
YANIRA LIZZETH LIMÓN CARRIÓN
ISOLAMENTO, BIOLOGIA E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE
BACTERIÓFAGOS PARA O MANEJO DA MURCHA-BACTERIANA DO
TOMATEIRO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Agronomia do Centro de
Ciências Agrárias e Engenharias da Universidade Federal do Espírito Santo, como parte
das exigências para obtenção do Título de Mestre em Agronomia, na área de
concentração Produção Vegetal, Linha de Pesquisa Proteção Sustentável de Plantas
(Fitopatologia).
Aprovada em 11 de fevereiro de 2022.
Comissão Examinadora:
_________________________________
Prof. Dr. Willian Bucker Moraes
Universidade Federal do Espírito Santo
Membro Interno - PPGAG-Ufes
______________________________
Profa. Dra. Cíntia dos Santos Bento
Universidade Federal do Espírito Santo
Membro Externo - PPGM-Ufes
_________________________________
Profa. Dra. Ana Elisa Silvera Pérez
Universidade da República Uruguay
Membro Externo - UDeLaR (Uruguay)
_________________________________
Prof. Dr. André da Silva Xavier
Universidade Federal do Espírito Santo
Orientador
Dedico
A Deus; sem ele eu não teria força e determinação para desenvolver
este trabalho.
Aos meus pais Máximo e Reyna, pois graças aos seus esforços, hoje
posso concluir o meu curso de pós graduação.
Ao meu orientador, o professor Dr. André da Silva Xavier, sem o
qual não teria conseguido concluir esta difícil tarefa.
A quem colaborou diretamente comigo, minha coorientadora, a Dra.
Fernanda Silva, sem a qual eu não teria concluído este projeto.
Todo sucesso é fruto de um grande trabalho em equipe. A todos meus
amigos da pós-graduação e parceiros do Laboratório de Virologia e
Biocontrole de Doenças de Plantas (LAVIB) que fizeram a minha
jornada mais completa e feliz.
Dedico este trabalho a todos os que me ajudaram ao longo desta
caminhada.
AGRADECIMENTOS
Devo minha conquista a Deus, meu coração exulta de gratidão e alegria por mais esta
vitória alcançada. Este triunfo não é apenas meu, mas antes é teu Deus!
Aos meus pais, devo tudo, tudo mesmo. Foram eles que me proporcionaram esse caminho
que me levou a tantas vitórias!
Querida mãe Maria del Carmen Carrión Maldonado (Reyna), a sua dedicação e o
seu amor são os maiores responsáveis pela pessoa que eu me tornei. Eu imagino que
muitas vezes não foi fácil seguir, sei que cansou muitas vezes. Hoje eu agradeço por,
apesar de todos os obstáculos, ter sempre seguido.
Querido Pai Maximo Limón Salazar, obrigado por ser a minha base, minha
inspiração a seguir na luta, você me mostrou seu amor e me deu tudo o que eu poderia
pedir a Deus. Sei que abdicou de muitas coisas para cuidar de mim, para me apoiar e para
me dar condições financeiras de seguir com os meus sonhos. Obrigado pais por me
amarem e terem dedicado tanta energia! Amo vocês com todas as minhas forças.
À minha família, especialmente meus irmãos Daniela, Max Fernando e Carlos
Eduardo por acreditarem em mim, meus tios que me deram seu apoio Genaro, Rosa,
Vilma e Teresa.
Aos meus amigos de longa data que sempre estiveram comigo me dando força,
apesar da distância e do tempo, Vanessa Medrano, Yonny Santos, Gustavo Fernandez
(Tato), Miriam Deusy, Noel Gonzales e Lidy Lizarazu.
Aos amigos Donato Montaño, Lucho Gadea, Juan Carlos Alvarez e Ana Isabel
Ortiz da Bolívia, que acreditaram no meu potencial e me incentivaram a realizar o sonho
de fazer o mestrado no Brasil.
Aos meus professores e especialmente ao meu orientador Prof. Dr. André da Silva
Xavier pela ajuda, pelo tempo despendido, pelo conhecimento fornecido e pela valiosa
mentoria.
Aos meus coorientadores Prof. Dr. Willian Bucker Moraes e Dra. Fernanda Silva,
pela coorientação e disponibilidade.
Às minhas amigas Emily Olive, Laura Vaillant e Vanessa Sessa pelo
companheirismo e amizade e pelos melhores cafés da tarde, sempre tão dispostas a escutar
as lamentações, apoiar-me e tornar os dias mais leves.
À University of Wisconsin-Madison (UW), Université Laval (UL) e Universidade
Federal Rural de Pernambuco (UFRPE) pelo apoio financeiro e suporte com a
infraestrutura para condução de alguns experimentos.
Agradeço ao programa de Pós-Graduação em Agronomia e às agências de
fomento a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil
(CAPES) e Fundação de Amparo à Pesquisa e Inovação do Espírito Santo (FAPES), pelo
suporte e a oportunidade para o desenvolvimento desta pesquisa científica.
Ao Centro de Ciências Agrárias e Engenharias da Universidade Federal do
Espírito Santo (CCAE-Ufes) e ao Programa de Pós-Graduação em Agronomia (PPGA),
pela oportunidade de cursar a Pós-Graduação.
Ao Núcleo de Desenvolvimento Científico e Tecnológico em Manejo
Fitossanitário de Pragas e Doenças (NUDEMAFI), pelos recursos financeiros e
infraestrutura disponibilizados para a condução do projeto.
À comissão examinadora, pela disponibilidade e contribuição na melhoria deste
trabalho.
O sucesso não se alcança sozinho, agradeço á todos que me apoiaram e
permitiram que este trabalho fosse realizado com sucesso no Brasil, a cada uma das
pessoas que me animaram no longo de meu caminho, colegas de laboratório, lunch e café,
o apoio que senti ao longo das rotinas de trabalho, dedicação a cada um dos professores
deste curso de pós-graduação, a quem dedico este trabalho.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento
de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.
Obrigada!
“Teu pior inimigo é a tua própria mente, porque ela é quem sabe todas tuas
debilidades.”
(Ever Espinoza)
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS x
INTRODUÇÃO GERAL 15
REFERÊNCIAS 20
CAPÍTULO I 23
Isolamento, biologia e caracterização molecular de novos bacteriófagos que infectam
isolados do Complexo Ralstonia solanacearum em solos do Espírito Santo, Brasil 23
RESUMO 24
ABSTRACT 26
1. 27
2. 29
2.1 Isolados bacterianos 31
2.1.1 Coleta e obtenção de isolados do Complexo Ralstonia solanacearum 31
2.1.2 Extração de DNA genômico bacteriano 31
2.1.3 "Phylotype-specific multiplex PCR" (Pmx-PCR) 32
2.1.4 Teste de patogenicidade para isolados de R. solanacearum oriundos do
Espirito Santo 33
2.1.5 Sequenciamento do mutante RsB70-PC e análises genômicas 33
2.1.5.1 33
2.1.5.2 Seleção dos genes para estudo e busca no genoma de isolado referência 34
2.1.5.3 34
2.1.5.4 Análise comparativa de loci determinantes para a produção de cápsula
(EPS) 35
2.2 Isolados virais 35
2.2.1 Coleta das amostras de água e solo 35
2.2.2 Detecção de bacteriófagos através de Spot Test 36
2.2.3 Isolamento, propagação, purificação parcial das partículas virais e
preservação 36
2.2.4 Cinética de infecção dos bacteriófagos 37
2.2.5 Gama de hospedeiros dos oitos bacteriófagos 38
2.2.6 Extração e caracterização dos ácidos nucleicos dos bacteriófagos 38
2.2.7 Sequenciamento e análise preliminar dos genomas dos bacteriófagos 39
2.2.8 Análise filogenética 40
2.3 Análises Estatísticas 40
3. 40
3.1 Os isolados do CRS oriundos do ES pertencem à espécie Ralstonia
solanacearum 41
3.2 Distintos solos do ES contém bacteriófagos líticos que infectam Ralstonia
solanacearum 42
3.3 Bacteriófagos líticos oriundos do ES apresentam distintos perfis de
agressividade 43
3.4 Bacteriófagos oriundos do ES infectam isolados das espécies R. solanacearum
e R. pseudosolanacearum e possuem mecanismos de infecção contrastantes 45
3.5 46
3.6 Bacteriófagos oriundos do ES são isolados de uma putativa nova espécie
relacionada aos taxa do gênero Bakolyvirus (Família: Myoviridae) 47
4. CONFLITO DE INTERESSES 49
5. AGRADECIMENTOS 49
6. REFERÊNCIAS 50
CONSIDERAÇÕES FINAIS 54
LISTA DE ABREVIATURAS
BDB: Blood disease bacterium
BLAST: Basic Local Alignment Search Tool
CPG: Cultura Caseína-Peptona Glicose 1,5% ágar
CRS: Complexo Ralstonia solanacearum ou (RSSC)
DNA: Deoxyribonucleic acid
EDTA: Ethylenediamine tetraacetic acid
IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
Int.: proteína chamada de integrase
SDS: Sulfato Dodecyl de Sódio
SM Buffer: Suspension Buffer (S Buffer)
LAVIB: Laboratório de Virologia Microbiana e Biocontrole de Doenças de Plantas
NCBI: The National Center for Biotechnology Information
NUDEMAFI: Núcleo de Desenvolvimento Científico e Tecnológico em Manejo
Fitossanitário de Pragas e Doenças
O.D.: Optical Density
PC: “Phenotypic Conversion”
PEG: Polietilenoglicol
Pmx-PCR: método de PCR multiplex
PVDF: Fluoreto de polivinilideno hidrofílico
RPM: Rotações Por Minuto
RNA: Ribonucleic acid
SDS: Dodecil sulfato de sódio
TAE: Tris-Acetato-EDTA
ToBYMV: Tomato bright yellow mosaic virus
ToBYMoV: Tomato bright yellow mottle virus
ToYYSV: Tomato yellow vein streak virus
UFC: Unidade formadora de colônias
UFP: Unidade formadora de placas de lise
Rs: Ralstonia solanacearum
Rps: Ralstonia pseudosolanacearum
RESUMO
A murcha-bacteriana ou murchadeira é uma fitobacteriose causada por isolados de no
mínimo três espécies de Ralstonia pertencentes a um grupo taxonômico heterogêneo
conhecido como complexo de espécies Ralstonia solanacearum (CRS). É uma das mais
importantes fitobacterioses que ocorre em diversas culturas de importância agronômica
como tomateiro, batata inglesa, banana, pimentão, tabaco, eucalipto, dentre outras. Os
agentes etiológicos do CRS são exímios habitantes dos solos o que agrava a ineficiência
do manejo, pois sobrevivem por longos períodos na ausência da planta hospedeira. Outro
fator crítico para o manejo é a ampla diversidade genética das bactérias do CRS e ampla
gama de hospedeiros, a antiga classificação hierárquica divide o CRS em quatro grupos
filogenéticos que possuem alta correlação com a origem geográfica, indicados como:
Filotipo I – Ásia; Filotipo IIA/IIB – Américas; Filotipo III – África e Filotipo IV –
Indonésia. Atualmente os quatro filotipos foram elevados à categoria de espécie. No
Brasil não existem antibióticos ou qualquer agroquímico registrado para o controle das
espécies do CRS presentes nas Américas (Ralstonia solanacearum (Filotipo II) e R.
pseudosolanacearum (Filotipo I)), sendo o combate a essa doença, realizado por meio do
manejo integrado, que inclui ações para evitar ferimentos causados por implementos
agrícolas, nematoides e insetos, eliminação de plantas cultivadas e não cultivadas doentes,
rotação de culturas, entre outros tratos culturais, contudo, o manejo da murcha não é
efetivo. Pesquisas realizadas tanto na Ásia quanto na América, indicam a potencialidade
de inimigos naturais de bactérias, conhecidos como bacteriófagos (vírus benéficos
capazes de infectar bactérias patogênicas), para o controle de fitobactérias. Dessa forma,
objetivou-se com a presente pesquisa investigar uma alternativa ecológica baseada em
fagoterapia (uso de bacteriófagos para manejo de fitobacterioses) para o manejo das
espécies do CRS e fortalecer as escassas estratégias para contornar os efeitos da murcha-
bacteriana. Especificamente, a atual pesquisa foi embasada na prospecção e
caracterização de bacteriófagos líticos capazes de infectar as espécies R. solanacearum e
R. pseudosolanacearum no Espírito Santo. Coletas de solo, água e plantas em municípios
de estados brasileiros, incluindo alguns do Espírito Santo foram realizadas para observar
a atividade bacteriolítica associada à vírus e/ou a presença de Ralstonia spp. em áreas de
cultivo com plantas hospedeiras, não hospedeiras de espécies do CRS, além de áreas de
fragmentos florestal. Paralelamente, isolados de espécies do CRS foram coletados para
serem utilizados como hospedeiros-isca na bioprospecção viral. Após a detecção da
atividade lítica, oito bacteriófagos (Phage Canuta, Phage Elisiario, Phage Laurinda, Phage
Ortiz, Phage Zilma, Phage Kapixawa, Phage Krenak e Phage Zacimba) foram isolados e
caracterizados por meio de abordagens biológicas e moleculares. Os isolados de Ralstonia
sp. coletados foram caracterizados molecularmente e preservados para o teste de gama de
hospedeiros. O teste da gama de hospedeiros com um painel de isolados mundiais do CRS
mostrou que os bacteriófagos infectam tanto R. solanacearum quanto R.
pseudosolanacearum, porém são mais agressivos quando inoculados em isolados de R.
solanacearum oriundos do Brasil e mais especificamente as linhagens do Espírito Santo,
de onde são originários. Quanto à agressividade acessada pela magnitude lítica durante a
fase exponencial de crescimento de R. solanacearum RsB70-PC, os bacteriófagos foram
classificados em três grupos (Agressividade Baixa, Moderada e Alta). A análise dos
genomas completos de pelo menos sete dos bacteriófagos revelou que se tratam de
isolados virais de uma nova espécie a ser catalogada e a reconstrução filogenética
permitiu inferir que os sete bacteriófagos isolados do Espírito Santo são estreitamente
relacionados aos taxa do gênero Bakolyvirus (Família Myoviridae). Com base nos
resultados, pode-se concluir que os bacteriófagos apresentam um interessante perfil de
atividade lítica contra isolados de Ralstonia spp. com potencial de ser explorado
biotecnologicamente para ampliar o portfólio de perspectivas ecológicas para manejo
integrado da murcha-bacteriana no campo. Futuras análises de caracterização genômica
mais detalhada serão conduzidas e reunirão os elementos necessários para viabilizar a
aplicação desses agentes de controle biológico ou de seus derivados.
Palavras chave: Controle biológico, Bactérias fitopatogênicas, Fagoterapia, Vírus,
Interação bactéria-vírus.
ABSTRACT
Bacterial wilt is a plant disease caused by bacteria strains of at least three species of
Ralstonia belonging to a heterogeneous taxonomic group known as Ralstonia
solanacearum species complex (RSSC). It is one of the most important bacterial plant
disease that occurs in several crops of agronomic importance such as tomato, potato,
banana, pepper, tobacco, eucalyptus, among others. The etiological agents of RSSC are
excellent inhabitants of the soil, which aggravates the inefficiency of management, as
they survive for long periods in the absence of the host plant. Another critical factor for
management is the wide genetic diversity of the RSSC strains and wide range of hosts,
the old hierarchical classification divides the RSSC into four phylogenetic groups that
have high correlation with the geographic origin, indicated as: Phylotype I – Asia;
Phylotype IIA/IIB – Americas; Phylotype III – Africa and Phylotype IV – Indonesia.
Currently the four phylotypes have been elevated to the category of species. In Brazil,
there are no antibiotics or any agrochemical registered for the control of RSSC strains
present in the Americas (Ralstonia solanacearum (Phylotype II) and R.
pseudosolanacearum (Phylotype I)), and the control of this disease is carried out through
integrated management, which includes actions to avoid injuries caused by implements.
agricultural, nematodes and insects, elimination of weeds and crops with bacterial wilt
symptoms, crop rotation among other cultural treatments, however, wilt management is
not effective. Research carried out in both Asia and America indicates the potential of
natural enemies of bacteria, known as bacteriophages (beneficial viruses capable of
infecting pathogenic bacteria), for the control of phytobacteria. Thus, the objective of the
present research was to investigate an ecological alternative based on phage therapy (use
of bacteriophages to manage bacterial plant disease) for the management of RSSC strains
and to strengthen the few strategies to circumvent the effects of bacterial wilt.
Specifically, the current research was based on the prospection and characterization of
lytic bacteriophages capable of infecting the species R. solanacearum and R.
pseudosolanacearum in Espírito Santo. Soil, water and plant collections in municipalities
of the Brazilian states, including some in Espírito Santo, were carried out to observe the
bacteriolytic activity associated with the virus and/or the presence of Ralstonia spp. in
cultivation areas with host plants, non-hosts of RSSC strains, in addition to areas of forest
fragments. At the same time, isolates of RSSC were collected to be used as bait hosts in
viral bioprospecting. After detection of lytic activity, eight bacteriophages (Phage Canuta,
Phage Elisiario, Phage Laurinda, Phage Ortiz, Phage Zilma, Phage Kapixawa, Phage
Krenak and Phage Zacimba) were isolated and characterized using biological and
molecular approaches. Ralstonia sp. collected were molecularly characterized and
preserved for host range testing. The host range test with a panel of RSSC strains
worldwide showed that bacteriophages infect both R. solanacearum and R.
pseudosolanacearum, but are more aggressive when inoculated into isolates of R.
solanacearum from Brazil and more specifically the strains from Espírito Santo, where
they come from. As for the aggressiveness assessed by the lytic magnitude during the
exponential growth phase of R. solanacearum RsB70-PC, the bacteriophages were
classified into three groups (Low, Moderate and High Aggressiveness). The analysis of
the complete genomes of at least seven of the bacteriophages revealed that they deal with
viral isolates of a new species to be cataloged and the phylogenetic reconstruction allowed
us to infer that the seven bacteriophages isolated in Espírito Santo are closely related to
the taxa of the genus Bakolyvirus (Family Myoviridae). Based on the results, it can be
concluded that bacteriophages have an interesting profile of lytic activity against isolates
of Ralstonia spp. with potential to be explored biotechnologically to expand the portfolio
of ecological perspectives for integrated management of bacterial wilt in the field. Future
analyzes of more detailed genomic characterization will be conducted and will gather the
necessary elements to enable the application of these biological control agents or their
derivatives.
Keywords: Biological control, Plant pathogenic bacteria, Phage therapy, Virus, Bacteria-
virus interaction.
15
INTRODUÇÃO GERAL
O tomateiro (Solanum lycopersicum L.) é uma hortaliça de alto valor comercial,
mundialmente conhecida e pertencente à família das solanáceas (Shirahige, 2010). O
cultivo dessa espécie pode ser acometido por diversos fatores, como condições
edafoclimáticas e bióticos que influenciam a produção e qualidade dos frutos.
Alternativas para contornar essas condições adversas têm sido o cultivo em ambientes
protegidos e a ampla variabilidade fenotípica da cultura que permitem a produção em
diferentes climas suprindo a demanda do produto em épocas menos favoráveis à sua
produção (Pereira 2012). Os frutos são de interesse na culinária, consumo “in natura”, e
para o preparo de derivados. Sua produção ocorre em praticamente todas as regiões
geográficas do mundo (Naika et al., 2006). É uma cultura com alto valor econômico no
Brasil, que tem se destacado nos últimos anos, como um dos dez maiores países
produtores desta hortaliça no mundo, com uma produção estimada em 4,0 milhões de
toneladas de acordo com a safra de 2020 (IBGE, 2021).
É uma cultura altamente suscetível à fitopatógenos como vírus, fungos,
oomicetos, nematoides e bactérias que causam sintomas em diferentes partes da planta,
incluindo folhas, frutos, caules, sistema vascular e raízes ocasionando redução da a
produtividade e/ou a morte da planta. Dentre os principais grupos de doenças podemos
destacar as fitonematoses (Meloidogyne spp.), Cancro bacteriano (Clavibacter
michiganensis subsp. michiganensis), geminiviroses (complexo de espécies do gênero
Begomovirus, Tomato bright yellow mosaic virus (ToBYMV), Tomato bright yellow
mottle virus (ToBYMoV), Tomato yellow vein streak virus (ToYYSV), dentre outros),
Murcha-bacteriana (complexo de espécies Ralstonia solanacearum), Murcha-de-fusário
(Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici), Requeima (Phytophthora infestans), dentre
outras (Naika et al., 2006; Brown et al., 2015).
16
Dentre as fitobacterioses, a murcha-bacteriana tem sido um problema em
determinadas áreas da Região Serrana do estado do Espírito Santo, causando grandes
danos nas lavouras de tomate, hortaliça de maior expressão social e econômica no Estado
(IBGE, 2008; Borel et al., 2010).
Essa fitobacteriose é de abrangência mundial, ocorrendo em regiões tropicais,
subtropicais e temperadas do globo. A doença afeta a produção de tomate, batata,
amendoim, banana, tabaco dentre outras culturas e é causada independentemente por por
no mínimo três espécies de Ralstonia, R. solanacearum, R. pseudosolanacearum e R.
syzygii, correspondentes a quatro filotipos pré-estabelecidos do Complexo R.
solanacearum (CRS). De acordo com Fegan & Prior (2005), os quatro filotipos podem
ser diferenciados a partir dos loci cromossomais correspondentes aos genes que codificam
os RNAs ribossomais 16S e 23S. Os filotipos I, II e III são encontrados na Ásia, América
e África, respectivamente, enquanto o filotipo IV é encontrado principalmente na
Indonésia, Japão, Austrália e Filipinas. Na classificação de Fegan & Prior (2005), o
filotipo IV, sendo o mais diverso, agregava as espécies R. solanacearum, R. syzygii e
BDB (blood disease bacterium) que atualmente são reconhecidas subespécies de R.
syzygii, já os filotipos I, II e III agregavam apenas a espécie R. solanacearum, porém
foram reestruturados taxonomicamente e agora, os filotipos I e III, são reconhecidos com
R. pseudosolanacearum e o filotipo II permanece como R. solanacearum.
A murcha-bacteriana trata-se de uma doença de difícil manejo devido a várias
características intrínsecas dos agentes etiológicos, tais como: sobrevivência por longos
períodos no solo (Rossato, 2016), ampla gama de hospedeiros (Genin & Denny, 2012;
Rossato, 2016) e uma grande capacidade de dispersão. O principal sintoma da doença é
resultante da interrupção parcial ou total do fluxo de água desde as raízes até parte aérea
da planta em função da colonização das células bacterianas no tecido vascular. Ao infectar
17
a planta hospedeira, as fitobactérias se alojam no xilema (Lopes, 2009) e uma vez
instaladas, não existem tratamentos curativos (Romeiro, 2005). Essa doença destrutiva, é
favorecida pela alta temperatura e umidade do solo, existem relatos de elevadas perdas
que variam de acordo com a cultura e genótipos dos patógenos. As bactérias sobrevivem
no solo e entram nas raízes das plantas novas através de ferimentos, principalmente
ocasionados pelos tratos culturais, a saber, cultivo, transplante, e além disso, insetos ou
certos fitonematoides. A disseminação dessas bactérias ocorre por meio da água de
irrigação, pela movimentação do solo ou, durante o transplantio, através do transporte de
plantas infectadas, além de solo contaminado aderido a maquinário e implementos
agrícolas ou até mesmo impregnado em calçados (Lopes, 2009).
No Brasil não existem antibióticos ou qualquer agroquímico registrado para o
controle de R. solanacearum ou R. pseudosolanacearum e o brometo de metila utilizado
durante vários anos para reduzir populações desses patógenos em solos e substratos foi
proibido com base no Protocolo de Montreal, pela Agência de Proteção Ambiental dos
Estados Unidos (Rosskopf et al., 2005). Na ausência de medidas eficientes para a
supressão desses patógenos, uma vez infectadas as plantas precisam ser eliminadas,
porém estratégias como a rotação de culturas, solarização do solo, manejo da água,
sanitização do material utilizados nos tratos culturais têm auxiliando na redução dos
impactos dessa fitobacteriose no campo (Romeiro, 2005; Kurozawa et al., 2005).
O biocontrole de fitobacterioses utilizando vírus (bacteriófagos) surge na
agricultura como um potencial recurso para integrar o manejo complexo dessas doenças
e vem sendo explorado nos últimos anos. Atualmente, já existem disponíveis no mercado
alguns biopesticidas produzidos pela empresa OmniLytics, registrados nos Estados
Unidos como o AgriPhage TM da Certis USA, AgriPhageTM-Bactericide, AgriPhageTM-
18
CMM, AgriPhageTM-Fire Blight e o AgriPhageTM -Citrus Canker (Business Wire, 2018),
mas nenhum desses produtos tem por alvo as espécies do CRS.
O potencial de alguns bacteriófagos em limitar eficientemente a colonização de
espécies do CRS e garantir a proteção contra a doença (Fujiwara et al., 2011; Addy et al.,
2012) tem aumentado gradativamente as expectativas para implementação dessa
alternativa no manejo da murcha-bacteriana na Ásia e recentemente na América (Xavier
et al., 2018).
Os bacteriófagos são vírus que infectam exclusivamente bactérias, e podem ser
encontrados e coletados em várias amostras ambientais, como água, solo, material
vegetal, rochas, dentre outras fontes. Ecologicamente, atuam no controle populacional
bacteriano e os mais abundantes da biosfera, os caudados, possuem uma estrutura de
capsídeo complexa, formada por uma cabeça, uma cauda e fibras da cauda. Na cabeça
está localizado o material genético, já a cauda e as fibras da cauda estão relacionadas com
o reconhecimento e ejeção do material genético no interior do citoplasma da célula
hospedeira (Calzadilla, 2014).
O termo "comedor de bactérias (Inglês: Bacteriophage)" deriva da capacidade de
atuarem como “nanopredadores” que podem romper células do hospedeiro ou mesmo
coexistir com ele, dependendo do tipo de ciclo viral. Existem bacteriófagos que
apresentam ciclo estritamente lítico, conhecidos como virulentos esses vírus multiplicam-
se e causam a lise (ruptura) da célula hospedeira antes da liberação da nova progênie viral,
sem integrar-se no cromossomo bacteriano. Já outros bacteriófagos apresentam um ciclo
conhecido como lisogênico, nesse caso, o genoma viral integra-se ao cromossomo
bacteriano durante a infecção e ambos, genoma viral e DNA cromossomal da bactéria
hospedeira, passam a coexistir ao longo do subsequente crescimento bacteriano, como
um “parasita molecular”, sendo conhecidos como profagos. Existem bacteriófagos que
19
apresentam tanto ciclo lítico quanto lisogênico, em um estilo de vida alternado, no qual,
além de causarem lise do hospedeiro sob determinados estresses/estímulos externos ainda
podem integrar-se ao DNA da bactéria, estes são conhecidos como bacteriófagos
temperados (Calzadilla, 2014). Na fagoterapia, é crucial que se tenha conhecimento sobre
a potencialidade de integração do bacteriófago ao genoma bacteriano, pois essa atividade
pode ter consequências negativas para o manejo da fitobacteriose. Por esse motivo, a
caracterização genômica de bacteriófagos deve ser um dos primeiros passos antes das
propostas de coquetéis virais, pois possibilita identificar se um bacteriófago é unicamente
lítico ou se o mesmo apresenta a capacidade de integrar-se ao genoma bacteriano, pois
quando lisogênicos, possuem assinaturas genômicas de integração, como por exemplo, o
grupo de genes que codificam proteínas Integrase (Int), essas enzimas são mediadoras de
eventos recombinogênicos entre o DNA do bacteriófago e o de seu hospedeiro em sítios
específicos (Khal, 2016).
A potencialidade desses agentes terapêuticos e a crescente demanda por práticas
sustentáveis estimulam a ressurgência no interesse pela utilização desses vírus benéficos
na agricultura, particularmente à luz do aumento da resistência bacteriana aos antibióticos
e o acúmulo de resíduos advindos do uso indiscriminado dos agrotóxicos (Balogh et al.,
2010). Atualmente, apesar da importância da murcha-bacteriana no país, o controle
biológico mediado por vírus na agricultura não tem sido amplamente investigado,
expondo uma lacuna científica sobre uma prática que tem potencial de fortalecer o manejo
integrado de fitobacterioses em território nacional.
20
REFERÊNCIAS
1. Addy, H. S., Askora, A., Kawasaki, T., Fujie, M., and Yamada, T. (2012). Loss
of virulence of the phytopathogen Ralstonia solanacearum through infection by
φRSM filamentous phages. Phytopathology 102, 469–477.
2. Balogh, B., Jones, J. B., Iriarte, F. B., & Momol, M. T. (2010). Phage therapy for
plant disease control. Current Pharmaceutical Biotechnology, 11(1), 48-57.
3. Borel, R. M. A., Abaurre, M. E. O., & CARMO, C. (2010). Características
socioeconômicas do cultivo do tomateiro no estado do Espírito Santo. Tomate.
Vitória-ES: Incaper, 69-84.
4. Brown, J. K., Zerbini, F. M., Navas-Castillo, J., Moriones, E., Ramos-Sobrinho,
R., Silva, J. C. & Varsani, A. (2015). Revision of Begomovirus taxonomy based
on pairwise sequence comparisons. Archives of Virology, 160(6), 1593-1619.
5. Business Wire, AgriPhage™-Fire Blight and AgriPhage™-Citrus Canker
Approved for Use to Control Bacterial Disease in Citrus and Pome Fruit. 2018.
Disponível em: <
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23
CAPÍTULO I
Isolamento, biologia e caracterização molecular de novos bacteriófagos que
infectam isolados do Complexo Ralstonia solanacearum em solos do
Espírito Santo, Brasil
24
Artigo a ser submetido para publicação no periódico Brazilian Journal of Microbiology
seção: Soil and Agricultural Microbiology
Isolamento, biologia e caracterização molecular de novos bacteriófagos que infectam
isolados do Complexo Ralstonia solanacearum em solos do Espírito Santo, Brasil
Yanira Lizzeth Limón Carrión1,3, Connor G. Hendrich2,3 , Fernanda Pereira da Silva1,
Lucas Romao Gava1 , Vanessa Sessa Dian1, Olivia Steidl2, Alícia Dutra de Oliveira
Moreira1,Wilian Rodrigues Ribeiro1, Willian Bucker Moraes1, Caitilyn Allen2* and André
da Silva Xavier1,4*
1Departamento de Agronomia, Universidade Federal do Espírito Santo, Alegre, ES, 29500-000,
Brazil
2Department of Plant Pathology, University of Wisconsin-Madison, Madison, WI, 53706, USA
3Esses autores tiveram contribuição equivalente.
*Autores para correspondência: andre.s.xavier@ufes.br (André da Silva Xavier) e
caitilyn.allen@wisc.edu (Caitilyn Allen)
RESUMO
A murcha-bacteriana é uma fitobacteriose que ocorre em importantes espécies cultivadas,
como o tomateiro, batata, banana e eucalipto. Um dos principais entraves para o manejo
dessa doença é a ausência de métodos eficazes para a supressão dos agentes etiológicos,
membros das espécies do Complexo Ralstonia solanacearum (CRS). Como uma
abordagem sustentável, a fagoterapia, que utiliza vírus específicos para combater
bactérias, conhecidos como bacteriófagos, vem se mostrando promissora contra diversas
fitobacterioses em diferentes continentes, incluindo a murcha-bacteriana em solanáceas.
Dessa forma, objetivou-se com esta pesquisa isolar e caracterizar bacteriófagos capazes
de infectar as espécies do CRS que ocorrem na América (R. solanacearum (Rs) e R.
pseudosolanacearum (Rps)). Coletas de solo, água e plantas foram conduzidas nos
Estados de Minas Gerais (MG), Espírito Santo (ES) e Pernambuco (PE) para acessar a
atividade bacteriolítica nas respectivas fontes amostrais. Das noventa e duas amostras
Estados de Minas Gerais (MG), Espírito Santo (ES) e Pernambuco (PE) para acessar a
atividade bacteriolítica nas respectivas fontes amostrais. Das noventa e duas amostras
filtradas e submetidas a ensaios de Spot test em CPG dupla camada contendo isolados-
isca de Rs, dez demonstraram forte atividade lítica, indicando a presença viral. Apenas
oito bacteriófagos foram recuperados e preservados após os procedimentos de detecção,
isolamento e purificação para os testes subsequentes. Em homenagem a líderes e
princesas de origem africana escravizados em terras capixabas, quilombolas, povos
25
originários e lideranças femininas ao longo da história do Espírito Santo, coube a equipe
envolvida nessa pesquisa, nomear os oito bacteriófagos isolados como: Phage Zacimba,
Phage Laurinda, Phage Ortiz, Phage Kapixawa, Phage Krenak, Phage Zima, Phage
Elisiario e Phage Canuta. A caracterização biológica dos oito bacteriófagos compreendeu
caracterização morfológica das placas de lise, gama de hospedeiros e monitoramento da
agressividade viral. Os bacteriófagos apresentam placas de lise de diâmetro variando
entre 1,5-2,4mm e infectam ambas espécies Rs e Rps em um painel de isolados mundiais
do CRS, no entanto são mais agressivos quando inoculados em isolados de Rs do Brasil,
especificamente os oriundos do ES. Quanto à agressividade, foram classificados em três
grupos: Baixa, Moderada e Alta de acordo com a magnitude lítica para declinar a
densidade ótica bacteriana durante a fase exponencial do hospedeiro RsB70-PC. Os
ácidos nucleicos de sete bacteriófagos, com exceção do Phage Zacimba, devido a
limitações encontradas para o isolamento do material genético, foram caracterizados
como DNAs de fita dupla (dsDNA), após tratamento enzimático com RNAse, DNAse e
S1 nuclease. O sequenciamento e a montagem do genoma dos sete bacteriófagos permitiu
inferir sobre os comprimentos aproximados dos genomas, em torno de 46.000 pb.
Análises de similaridade nucleotídica (%) utilizando a ferramenta BlastN da plataforma
NCBI com os genomas completos indicam que os sete bacteriófagos devem se tratar de
isolados de uma nova espécie da família Myoviridae, estreitamente relacionada com
membros do gênero Bakolyvirus. A filogenia utilizando a conservada proteína capsidial
principal “Major Capsid protein” reconstruída com taxa pertencentes a várias famílias
virais reforçou as observações prévias do posicionamento taxonômico provisório.
Análises genômicas complementares irão fornecer elementos importantes sobre um
potencial novo agente de controle biológico que poderá auxiliar nas propostas de manejo
sustentável da murcha-bacteriana.
Palavras chave: Bactérias fitopatogênicas, Murcha-bacteriana, Fagoterapia, Myovírus,
Interação bactéria-vírus.
26
ABSTRACT
Bacterial wilt is a plant disease that occurs in important crop species, such as tomato,
potato, banana and eucalyptus. One of the main obstacles to the management of this
bacterial plant disease is the lack of effective methods for suppressing the etiological
agents, members of the species of the Ralstonia solanacearum Complex (RSSC). As a
sustainable approach, phage therapy, which uses specific viruses to fight bacteria, known
as bacteriophages, has shown promise against several bacterial plant disease on different
continents, including bacterial wilt in nightshades. Thus, the objective of this research
was to isolate and characterize bacteriophages capable of infecting RSSC strains that
occur in America (R. solanacearum (Rs) and R. pseudosolanacearum (Rps)). Soil, water
and plant collections were carried out in the states of Minas Gerais (MG), Espírito Santo
(ES) and Pernambuco (PE) to assess the bacteriolytic activity in the respective sample
sources. Of the ninety-two samples filtered and subjected to Spot test assays in double
layer CPG containing Rs-bait strains, ten showed strong lytic activity, indicating the
presence of viruses. Only eight bacteriophages were recovered and preserved after
detection, isolation and purification procedures for subsequent tests. In honor of African
leaders and princesses enslaved in Espírito Santo lands, quilombolas, native peoples and
female leaders throughout the history of Espírito Santo, the team involved in this research
was responsible for naming the eight isolated bacteriophages as: Phage Zacimba, Phage
Laurinda, Phage Ortiz, Phage Kapixawa, Phage Krenak, Phage Zima, Phage Elisiario and
Phage Canuta. The biological characterization of the eight bacteriophages comprised
morphological characterization of lysis plaques, host range and monitoring of viral
aggressiveness. Bacteriophages present lysis plaques with a diameter ranging from 1.5-
2.4mm and infect both Rs and Rps species in a panel of RSSC strains worldwide, however
they are more aggressive when inoculated into Rs strains from Brazil, specifically those
from ES. As for aggressiveness, they were classified into three groups: Low, Moderate
and High according to the lytic magnitude to decline bacterial optical density during the
exponential phase of the host RsB70-PC. Nucleic acids from seven bacteriophages, with
the exception of Phage Zacimba, due to limitations found in phage nucleic acid isolation
procedures, were characterized as double-stranded DNA (dsDNA), after enzymatic
treatment with RNAse, DNAse and S1 nuclease. The sequencing and assembly of the
genome of the seven bacteriophages allowed inferences about the approximate lengths of
the full genome, around 46,000 bp. Nucleotide similarity analyzes (%) using the BlastN
tool of the NCBI platform with complete genomes indicate that the seven bacteriophages
must deal with isolates of a new species of the Myoviridae family, closely related to
members of the Bakolyvirus genus. The phylogeny using the conserved major capsid
protein reconstructed with taxa belonging to several viral families reinforced the previous
observations of the provisional taxonomic positioning. Complementary genomic analyzes
will provide important insights into a potential new biological control agent that could
assist in proposals for the sustainable management of bacterial wilt.
Key words: Plant pathogenic bacteria, Bacterial wilt, Phage therapy, Myoviruses,
Bacterial-virus interaction.
27
1. INTRODUÇÃO
Ralstonia solanacearum compreende um complexo bacteriano denominado de
Complexo Ralstonia solanacearum (CRS), constituído por três espécies, R. syzygii, R.
solanacearum e R. pseudosolanacearum (Fegan & Prior, 2005). O CRS é geneticamente
composto por quatro filotipos que podem ser diferenciados a partir dos loci cromossomais
correspondentes aos genes que codificam os RNAs ribossomais 16S e 23S. Os filotipos
I, II e III são encontrados na Ásia, América e África, respectivamente, enquanto o filotipo
IV é encontrado principalmente na Indonésia, Japão, Austrália e Filipinas. Na
classificação de Fegan & Prior (2005), o filotipo IV, abrigava o mais diverso painel de
isolados, agregava as espécies R. solanacearum, R. syzygii e BDB (blood disease
bacterium), que atualmente são reconhecidas subespécies de R. syzygii. Já os filotipos I,
II e III que agregam apenas isolados da espécie R. solanacearum, foram reestruturados
taxonomicamente e agora, os filotipos I e III, são reconhecidos com R.
pseudosolanacearum e o filotipo II permanece como R. solanacearum (Paudel et al.,
2020).
As bactérias pertencentes às espécies R. solanacearum e R. pseudosolanacearum
desempenham um importante papel econômico em uma ampla gama de hospedeiros no
mundo todo. São mais de 200 espécies de plantas acometidas, dentre elas o tomateiro
(Solanum lycopersicum L.), causando a doença conhecida como murcha-bacteriana (Prior
et al., 2016). O ciclo da doença se inicia quando as bactérias infectam as plantas por meio
das raízes, colonizam o sistema vascular (xilema), e por meio de diversos mecanismos
fisiológicos obstruem os vasos causando a murcha (Prior et al., 2016).
O estabelecimento da murcha-bacteriana no campo se deve às particularidades de
espécies do CRS, como a sobrevivência por longos períodos em associação com
hospedeiros alternativos no campo, facilidade de disseminação pelo solo, água de
irrigação, água de superfície, equipamentos agrícolas e material biológico infectado, além
da ampla gama de hospedeiros (Mansfield et al., 2012). Os métodos existentes para
realizar o manejo da murcha-bacteriana possuem eficácia limitada, o que dificulta o
manejo que continua a ser um problema economicamente sério para a produção em muitas
regiões do mundo, especialmente as tropicais e subtropicais (Wicker et al., 2007; Sagar
et al., 2014; Wei et al., 2017).
28
No Brasil não existem antibióticos ou qualquer agroquímico registrado para o
controle de R. solanacearum ou R. pseudosolanacearum e o brometo de metila utilizado
durante vários anos para reduzir populações desses patógenos em solos e substratos foi
proibido com base no Protocolo de Montreal, pela Agência de Proteção Ambiental dos
Estados Unidos (Rosskopf et al., 2005). Não existem medidas adequadas para o manejo
dessa fitobacteriose e uma vez infectadas as plantas precisam ser eliminadas. (Romeiro,
2005; Kurozawa, Krause-Sakate, 2005).
Considerando as dificuldades encontradas para realizar o controle de
fitopatógenos de importância agrícola como R. solanacearum, propostas de biocontrole
tem ganhado destaque, dentre elas a aplicação de bacteriófagos líticos, por meio de um
método denominado de fagoterapia (Doss, et al., 2017). A fagoterapia é um método de
controle de fitobacterioses mediado por vírus (bacteriófagos) que se automultiplicam em
células bacterianas e são altamente específicos (Modi, 2001). O potencial de alguns
bacteriófagos em limitar eficientemente a colonização dessas bactérias e garantir a
proteção contra a doença (Fujiwara et al., 2011; Addy et al., 2012) tem aumentado
gradativamente as expectativas para implementação dessa alternativa no manejo da
murcha-bacteriana na Ásia e recentemente na América (da Silva Xavier et al., 2018).
Existem inúmeros estudos relatando uma alta diversidade de bacteriófagos que
infectam isolados de R. solanacearum isoladas. Em um dos trabalhos foram relatados 72
fagos na Coréia e dentre eles, o bacteriófago RpY1, pertencente à família Podoviridae,
que possui uma ampla gama de hospedeiros (Lee SY, et al., 2021). Na América, o fago
denominado de Jumbo RsoM2USA foi isolado em solo de um campo de tomateiro na
Flórida (EUA), pertencente à família Myoviridae, demonstrou uma ampla especificidade
pelo hospedeiro e foi eficaz na supressão de isolados do CRS (Ahmad AA et al., 2021).
Outro fago lítico capaz de infectar R. solanacearum foi completamente sequenciado, na
China, um podovírus denominado de RSPI1 (Su J. et al., 2017). Três bacteriófagos líticos
vRsoP-WF2, vRsoP-WM2 e vRsoP-WR2, membros da família Podoviridae, provocaram
reduções na incidência da murcha-bacteriana em tomateiro (Álvarez et al., 2019). Em
outra pesquisa foi feito um coquetel (P1) de doze bacteriófagos líticos P-PSG-1, P-PSG-
2, P-PSG-3, P-PSG-4, P-PSG-5, P-PSG-6, P-PSG 7, P-PSG-8, P-PSG-9, P-PSG-10, P-
PSG-11 e P-PSG-12 obtidos de diferentes fontes de águas no Quênia e na China, foi eficaz
na prevenção da murcha-bacteriana (Wei C. et al., 2017).
29
A potencialidade desses agentes terapêuticos e a crescente demanda por práticas
sustentáveis estimulam a ressurgência no interesse pela utilização desses vírus benéficos
na agricultura, particularmente à luz do aumento da resistência bacteriana aos antibióticos
e o acúmulo de resíduos advindos do uso indiscriminado dos agrotóxicos (Balogh et al.
2010). Apesar da importância da doença no país, o controle biológico mediado por vírus
na agricultura não tem sido investigado.
Os bacteriófagos são considerados seguros e eficientes contra diversas doenças
bacterianas (Wei et al., 2017; Doss et al., 2017) o que tem refletido atualmente em um
crescente número de biopesticidas disponíveis no mercado, produzidos pela empresa
OmniLytics, registrados nos Estados Unidos para o controle de bacterioses em hortaliças
e fruteiras, como o AgriPhage ™ da Certis USA, AgriPhage ™ Bactericida, AgriPhage
™ CMM, AgriPhage ™ Fire Blight, AgriPhage ™ Citrus Canker (Business Wire, 2019).
Porém ainda não existe produtos comerciais para o CRS, o Brasil não tem adquirido essas
formulações à base de bacteriófagos pois a alta especificidade desses agentes de controle
biológico impossibilita na maioria dos casos que esses produtos sejam efetivos contra
isolados dos patógenos nativos de outros países e/ou continentes.
Considerando que R. solanacearum é um patógeno importante para diversas
culturas, que as dificuldades encontradas para o manejo no campo persistem, e que os
solos do Espírito Santo ainda não foram investigados quanta a presença de bacteriófagos
capazes de infectar espécies do CRS, objetivou-se com este trabalho isolar e caracterizar
bacteriófagos líticos capazes de infectar R. solanacearum e R. pseudosolanacearum, em
solos do Estado do Espírito Santo, visando a futura aplicação desses vírus selecionados
ou mesmo de seus derivados bioengenheirados para o manejo da murcha-bacteriana.
2. MATERIAL E MÉTODOS
A pesquisa foi desenvolvida no Centro de Ciências Agrárias e Engenharias da
Universidade Federal do Espírito Santo (CCAE-UFES), município de Alegre (20°45’ S;
41°29’W), sul do estado do Espírito Santo. A primeira etapa do trabalho foi conduzida
no laboratório de Virologia e Biocontrole de Doenças de Plantas (LAVIB) do
CCAE/UFES, e a segunda etapa foi realizada em parceria com colaboradores
internacionais da University of Wisconsin-Madison (EUA).
30
2.1 Isolados bacterianos
2.1.1 Coleta e obtenção de isolados do Complexo Ralstonia solanacearum
Amostras de solo e plantas de tomateiro contendo sintomas de murcha-bacteriana
para prospecção de bacteriófagos foram coletadas em cultivos de tomateiro localizados
no município de Afonso Cláudio e Venda Nova do Imigrante no estado do Espírito Santo.
Em seguida, as amostras foram encaminhadas ao Laboratório de Virologia e Biocontrole
de Doenças de Plantas (LAVIB) do CCAE/UFES, Alegre-ES para que fosse realizado o
isolamento direto de Ralstonia spp. O isolamento foi feito em placas de Petri contendo
meio de cultura Caseína-Peptona-Glicose (CPG) 1,5% agar + TTC (2,3,5 -
Triphenyltetrazolium chloride).
2.1.2 Extração de DNA genômico bacteriano
O DNA genômico dos isolados bacterianos foi extraído a partir de isolados
bacterianos cultivados por 48 horas em meio de cultura Caseína-Peptona Glicose 1,5%
ágar, os quais foram recuperados em microtubos de 1,5 mL contendo 500µL de
Suspension Buffer (S Buffer) (10% Sacarose, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM EDTA
(pH 8,0), 50 nM NaCl). Após a homogeneização em vórtex por 3 min, foram adicionados
20 µL de Lisozima (10 mg /ml) na suspensão de células e incubados em banho-maria a
37°C por 45 min, realizando-se vigorosas inversões em intervalos de 15 min, seguido pela
adição de 5µL de Proteinase K (20 mg/ml) e novamente incubados a 37°C por 45 min.
Em seguida, adicionou-se 50 µL de SDS (20% p/v) e incubados novamente em banho-
maria a 65°C por 45 min. O lisado foi centrifugado a 11.000 x g por 3 min a 20°C com
o propósito de sedimentar os detritos celulares no fundo dos microtubos para então ser
realizada a coleta e a transferência do sobrenadante para um novo microtubo de 1,5 mL
contendo 20 µL de RNAse A (5 mg/ml) com posterior incubação em banho-maria a 37°C
por 45 min.
31
Para promover a precipitação de proteínas celulares e outros resíduos celulares foi
adicionado o equivalente a 0,35X de acetato de potássio 2,5 M (pH 8,0) e realizados de
15 a 20 suaves inversões para retomar para a centrífuga em rotação baixa (6500 x g) e
alta (8000 x g) a 20°C por 3 min a fim de promover a sedimentação do precipitado. O
sobrenadante foi novamente coletado e transferido para um novo microtubo de 1,5 mL
com o mesmo volume de sobrenadante coletado de isopropanol, sendo realizadas suaves
inversões e incubando por 5 min em temperatura ambiente. Após a incubação a solução
foi centrifugada a 11.000 x g a 4°C por 20 min para haver a sedimentação do DNA e para
o descarte do sobrenadante. Os pellets de DNA foram lavados duas vezes com 200µL
etanol 70% e após cada adição os microtubos foram levados para a centrífuga a 11.000 x
g a 4°C por 2 min e posterior descarte do sobrenadante. Uma nova centrifugação a 11.000
x g a 4°C por 2 min foi realizada para que ocorra a descida do etanol 70% remanescente
presente nas paredes dos microtubos. Após esse procedimento os microtubos foram
deixados em aberto para a finalização da secagem em capela durante 10 min e os pellets
ressuspendidos em 50µL de TE (pH 8,0) e armazenados a -20 °C.
2.1.3 "Phylotype-specific multiplex PCR" (Pmx-PCR)
Para a identificação de espécies (filotipos) a nível molecular dos isolados
bacterianos coletados, utilizou-se o método de PCR multiplex (Pmx-PCR), adaptado por
Albuquerque et al. (2014). Para o mix de oligonucleotídeos, foi feita uma solução de
500µL contendo l0µL de cada um dos oligonucleotídeos: Nmult;2l:IF (100µM), Nmult
21:2F (100µM), Mult:23:AF (100µM), Nmult:22:InF (100µM) e Nmult:22:RR (100µM),
5µL dos oligonucleotídeos 759 (100µM) e 760 ( 100µM) e 440µL de água ultrapura
esterilizada. O mix da reação de Pmx-PCR, foi preparado para o volume final de 25µL
contendo 3,75µL de água ultrapura, 12,50µL de FIREPOL 5X Master Mix 12.5mM da
marca Solis Biodyne, 2,50µL do mix de oligonucleotídeos e 2,00µL de DNA (10 ng/µL).
O programa de ciclagem em termociclador foi constituído de uma etapa de desnaturação
inicial, tendo apenas 1 ciclo e a condição foi de 96°C/ 5 min, na etapa de desnaturação a
temperatura foi de 94°C/30s, na de anelamento a condição foi de 59 °C/90s e na etapa de
extensão a temperatura foi de 72°C/90s (em conjunto, essas três etapas tiveram 30 ciclos).
32
Os fragmentos amplificados foram separados por meio de eletroforese em gel de agarose
1,8%. Os amplicons foram carregadas em gel de acordo com as seguintes proporções de
componentes (15µL das reações + l µL de GelRed 1:100 +2µL de 6x loading dye) e a
corrida em TAE 1X a 80V e 400mA por 3 horas. As amostras e os perfis genômicos foram
verificados sob transiluminação UV (254 nm) e comparados ao perfil de bandeamento
dos isolados referência para os filotipos que ocorrem nas Américas.
2.1.4 Teste de patogenicidade para isolados de R. solanacearum oriundos do Espírito
Santo
Após a caracterização molecular, foi realizado um teste adicional de
patogenicidade em casa de vegetação, utilizando-se plantas de tomateiro cv. Bonne best
para observar se os isolados bacterianos locais preservam a habilidade de causar doença
e quais deles apresentavam maior agressividade ao infectar as plantas. Utilizamos um
método de inoculação mais aproximado do contexto das infecções no campo,
adicionando-se o inóculo inicial no próprio solo a uma concentração de 5xl07 UFC/mL.
O mesmo solo foi utilizado para o plantio de mudas de tomateiro e as plantas foram
monitoradas por um período de 15 dias. A avaliação da incidência (ID) da murcha-
bacteriana no experimento foi feita com base em escala diagramática com valores de 0 a
5, onde: 0 = ausência de sintomas; 1 = apenas uma folha parcialmente murcha; 2 = duas
ou três folhas murchas; 3 = todas as folhas murchas exceto duas ou três; 4 = todas as
folhas murchas; 5 = planta morta.
2.1.5 Sequenciamento do mutante RsB70-PC e análises genômicas
O sequenciamento foi realizado em parceria com a Universidade de Wisconsin –
Madison, utilizando NGS “Next generation Sequencing” - Sequenciamento de Nova
Geração, capaz de superar a limitação de alguns métodos que exigem informação prévia
sobre as sequências ou organismos alvo da investigação. Dentre as plataformas de NGS
existentes, foi utilizado a Illumina HiSeq 3000, executando o sequenciamento por síntese
de base (SBS). O método identificou simultaneamente as bases de DNA enquanto as
incorporava a uma cadeia de ácidos nucleicos. Cada base emitiu um sinal fluorescente
33
único à medida que foi adicionado à cadeia crescente, que foi utilizada para determinar a
ordem da sequência de DNA.
2.1.5.1 Montagem e Anotação do genoma do mutante RsB70-PC
Após as leituras obtidas a partir do sequenciamento, o genoma foi montado,
ordenado e enumerado em contigs, utilizando os softwares Geneious 10.1.2 e Spades v.
3.11.1 tendo como referência genomas estritamente relacionados com o do mutante (R.
solanacearum) presentes no banco de dados públicos de sequências, GenBank. Uma vez
a montagem finalizada, as ORFs (“Open reading frame”) foram determinadas após a
anotação do genoma montado, utilizando o Prokaryotic Genome Annotation Pipeline
(PGAAP) do NCBI.
2.1.5.2 Seleção dos genes para estudo e busca no genoma de isolado referência
Baseando-se na literatura de acordo com Huang et al., 1995; Clough et al.,
1997; Schell, 2000, fez-se a seleção de genes responsáveis pela virulência em R.
solanacearum e determinantes para a produção de EPSI (cápsula). Os isolados referência
do filotipo II utilizados para análise de sintenia e genômica comparativa foram:
CFBP2957 (EMBL: FP885897, FP885907 - Ralstonia solanacearum CFBP2957
chromosome complete genome - Nucleotide - NCBI) e Po82 (NCBI: CP002819,
CP002819.1 - Ralstonia solanacearum Po82, genoma completo - Nucleotídeo - NCBI).
A partir da plataforma do INRAE (l'Institut National de Recherche pour
l'Agriculture, l'Alimentation et l'Environnement, realizou-se a busca dos genes
selecionados nos isolados CFBP2957 e Po82 para definir a posição genômica e por meio
do software uGene v 1.1, servidor Operon Mapper e plataforma BLAST/NCBI, reportou-
se em quais operons estes genes estavam inseridos e suas respectivas sequências.
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1046/j.1365-2958.2003.03605.x?sid=nlm%3Apubmed#b17
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1046/j.1365-2958.2003.03605.x?sid=nlm%3Apubmed#b18
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1046/j.1365-2958.2003.03605.x?sid=nlm%3Apubmed#b18
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1046/j.1365-2958.2003.03605.x?sid=nlm%3Apubmed#b19
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/FP885897.1?report=fasta&from=733605&to=734648
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/FP885897.1?report=fasta&from=733605&to=734648
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CP002819.1
34
2.1.5.3 Alinhamento de loci candidatos do mutante RsB70-PC com o isolada
referência CFBP2957
Após encontrados os operons, os quais cada gene estava localizado no isolado
CFBP2957, a sequência destes foi recortada e alinhada em gaps com a sequência do
mutante RsB70-PC. O alinhamento foi feito utilizando o software MegaX v. 11.0 para
obter a comparação dos loci candidatos contendo os genes de interesse previamente
descritos no item 2.1.5.2.
2.1.5.4 Análise comparativa de loci determinantes para a produção de cápsula (EPS)
Posteriormente ao item 2.1.5.3, através da comparação dos loci feita pelo
alinhamento entre o genoma do mutante RsB70-PC e o genoma do isolado referência
CFBP2957 previamente depositados no banco de dados (GenBank) do NCBI, foi
realizada a análise de sintenia genômica utilizando os softwares/ferramentas de
bioinformática MegaX v. 11.0 (www.megasoftware.net) e Reverse Complement
(https://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html). A partir destas análises inferiu-se
sobre o(s) tipo(s) de mutação(s), em qual locus especificamente ocorreu e as implicações
funcionais para o produto do gene mutado.
2.2 Isolados virais
2.2.1 Coleta das amostras de água e solo
As amostras de água e solo foram coletadas em campos de produção de
solanáceas e outras culturas tanto hospedeiras quanto não hospedeiras de espécies do
Complexo Ralstonia solanacearum, com histórico de incidência da murcha-bacteriana e
algumas áreas não agricultáveis (fragmentos de floresta) nos Estados de Minas Gerais
(MG), Espírito Santo (ES) e Pernambuco (PE). As amostras de solo foram coletadas em
solo rizosférico de plantas sintomáticas e assintomáticas. As amostras de água foram
35
coletadas em vários pontos dos afluentes próximos aos locais de incidência da doença ou
não, em percurso aleatório.
2.2.2 Detecção de bacteriófagos através de Spot Test
Para a detecção de bacteriófagos as amostras coletadas, aproximadamente 1 g de
solo, foram ressuspendidas em 2 mL de água destilada, homogeneizadas no vórtex e em
seguida centrifugadas a 12000 rpm durante 5 minutos e o sobrenadante filtrado em filtro
com membrana PVDF 0,22 µm. Para as amostras de água, uma alíquota de 100 µL de
cada amostra foi submetida ao método de detecção de placas de lise em sobrecamada de
CPG semi-sólido 0,4% (Adams, 1959). O hospedeiro bacteriano utilizado para detecção
de bacteriófagos foi um isolado do CRS, R. solanacearum RsB70-PC, um mutante
avirulento incapaz de produzir cápsula pertencente à bacterioteca LAVIB NUDEMAFI.
2.2.3 Isolamento, propagação, purificação parcial das partículas virais e preservação
Os bacteriófagos detectados foram (“isolados”) a partir de uma única placa de
lise isolada, utilizando o isolado R. solanacearum RsB70-PC como hospedeiro. Após
incubação a 28 °C por 48 horas, placas de lise isoladas foram recortadas e propagadas.
Esse procedimento foi realizado com cada amostra que apresentou atividade
lítica é repetido três vezes em sequência para a obtenção das partículas virais isoladas
para posteriores análises. Para a propagação dos bacteriófagos, o isolado RsB70-PC foi
cultivado em meio de cultura CPG líquido e incubado por 12 horas a 28 °C sob agitação
de 200 rpm. Após o período de incubação a bactéria foi diluída em meio de cultura CPG
líquido a uma OD600=0,2, em seguida submetida à infecção viral e incubada por 12 horas
a 28 °C a 200 rpm. Cada um dos bacteriófagos isolados foi propagado na cultura líquida
do isolado RsB70-PC e após esse período, as células bacterianas foram removidas por
centrifugação a 8000 rpm durante 15 minutos, a 4°C. O sobrenadante foi filtrado
utilizando filtro de membrana PVDF de 0,22 µm (Millex-GV Syringe Filter, Merck
Millipore). Em seguida as partículas virais foram precipitadas na presença de 0,5 M NaCl
e 5% de polietileno glicol 6000 (p/v) e centrifugadas a 15.000 rpm durante 30 minutos.
O sobrenadante foi descartado e o sedimento ressuspendido em Tampão SM (50 mM
36
Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgSO4 e 0,01% de gelatina) a 4°C. As
suspensões de partículas virais parcialmente purificadas foram armazenadas a 4°C e
adicionalmente criopreservadas com glicerol em ultra-freezer -80°C.
Para determinar a quantidade de Unidades formadoras de placas de lise virais
(UFP/ml) nas suspensões virais, foi realizada a titulação viral dos bacteriófagos
propagados. Primeiramente, fez-se a diluição seriada das suspensões virais até 10-9 em
tampão SM Buffer (900 µL de SM + 100 µL de bacteriófago). Transferiu-se alíquotas de
250 µL de cada diluição para microtubos de 1,5 mL com 500 µL da cultura do RsB70-
PC em fase Log OD600 = 0,4, incluindo a amostra sem diluir (100), e esperou-se de 10-
15min para que houvesse adsorção do bacteriófago. Após o tempo de adsorção, realizou-
se o plaqueamento em sobrecamada de meio CPG semi-sólido (0,4% ágar) adicionando-
se os 750µL (volume total) contidos nos microtubos (250 µL da diluição de cada
suspensão viral + 500 µL de cultura bacteriana) em 6mL de CPG semi-sólido formando
a sobrecamada na placa de Petri com meio sólido (1,5% ágar). As placas foram incubadas
overnight a 28ºC e posteriormente ao período de incubação, para o cálculo do título viral,
foi feita a contagem das placas de lise formadas. Para isso, considerou-se as placas de
Petri com quantidade de 30-300 placas de lise. Utilizou-se a seguinte fórmula:
2.2.4 Cinética de infecção dos bacteriófagos
A cinética de infecção dos bacteriófagos foi avaliada em culturas líquidas de R.
solanacearum isolado RsB70-PC para acessar a agressividade viral a partir da
quantificação da magnitude viral lítica. Para tanto, alíquotas de 200 μL da suspensão
bacteriana com aproximadamente 1x108 UFC/mL (OD600=0.2), previamente cultivada em
caldo CPG, foram transferidas para microplacas de poliestireno de 96 poços e acrescidas
de 50 μL das suspensões virais de cada bacteriófago isolado. A microplaca foi incubada
sob agitação (200 rpm) em um leitor de microplacas (Multiskan GO Elisa (Thermo
Scientific) à 29 °C por 10 horas. As leituras da densidade óptica (OD600nm) foram
realizadas a cada 30 minutos, e os valores obtidos foram utilizados para construir as
37
curvas de crescimento de R. solanacearum RsB70-PC infectadas ou não com os diferentes
bacteriófagos. Assim, foram realizados oito tratamentos com as seguintes combinações:
RsB70-PC + Phage Zacimba, RsB70-PC + Phage Ortiz, RsB70-PC + Phage Elisiario,
RsB70-PC + Phage Zilma, RsB70-PC + Phage Krenak, RsB70-PC + Phage Kapixawa,
RsB70-PC + Phage Canuta e RsB70-PC + Phage Laurinda, e dois controles negativos:
RsB70-PC (250uL) e CPG 0% (250uL). No total foram realizadas oito repetições por
tratamentos.
2.2.5 Gama de hospedeiros dos oitos bacteriófagos
A infectividade dos bacteriófagos foi avaliada contra um painel mundial de
isolados de espécies do Complexo R. solanacearum dos filotipos (I, II, III e IV),
utilizando o método de sobrecamada com meio CPG semi-sólido (0,4%) (Adams, 1959)
e o isolado Ralstonia solanacearum RsB70-PC. O título viral das suspensões de cada
bacteriófago utilizadas para inocular os isolados foram 107, 106 e 105 UFP/mL-1. A
ocorrência de zonas de lise confluente na sobrecamada de CPG semi-sólido após
incubação a 28°C durante 24 horas, foi interpretada como suscetibilidade (S) e a ausência
como resistência (R), quando necessário subtipos fenotípicos foram designados dentro de
cada reação dos hospedeiros bacterianos.
2.2.6 Extração e caracterização dos ácidos nucleicos dos bacteriófagos
A partir da propagação das partículas virais foram extraídos os ácidos nucleicos.
Em 250mL de suspensão do hospedeiro a uma OD600= 0,2 foram adicionados 10 mL do
filtrado de cada isolado viral em um Erlenmeyer de 500mL. Em seguida as culturas foram
incubadas em shaker a 200 rpm na temperatura de 30°C por 9 horas. Após a incubação
foi realizada a centrifugação da suspensão a 8000 x g por 15 minutos e o sobrenadante
filtrado em filtro de membrana de 0,22 µm, para a obtenção das partículas virais puras, e
armazenado a 4°C até sua utilização. A próxima etapa consistiu em realizar a precipitação
das partículas virais utilizando PEG 8000 ou 6000 a 5% acrescido de solução de NaCl até
atingir uma concentração final de l M. O pellet foi dissolvido e em seguida as amostras
foram incubadas a 4°C por 48 horas. As amostras, após 48 h armazenadas a 4°C, foram
38
centrifugadas a 15000 x g por 30 minutos a 4°C. O sobrenadante foi descartado com
cuidado para não perder o precipitado e em seguida o pellet formado foi ressuspendido
cuidadosamente, adicionando-se de 2 a 3 mL de solução tampão SM Buffer. Em seguida,
foi realizado o tratamento das respectivas amostras de vírus com as enzimas RNAse A
(clivam moléculas de RNA) e S1 nuclease (clivam moléculas de ssRNA), para a
eliminação de qualquer ácido nucleico que não sejam provenientes dos vírus. Para uma
suspensão de 500µL de vírus foi adicionado 2,5 U de DNAse I juntamente com o tampão
10X da mesma, posteriormente foi adicionado 6,5µg de RNAse A, as amostras tratadas
com as enzimas foram incubadas por 1 hora a 37°C em banho-maria. Para a inativação
das enzimas, adicionou-se um volume de EDTA (pH 8) às amostras até que se atingisse
uma concentração final de 15 mM. Novamente as amostras foram incubadas em banho-
maria, porém, desta vez a uma temperatura de 75°C por 10 minutos para completar a
inativação das enzimas. Esperou-se esfriar por aproximadamente 20 minutos e
posteriormente adicionou-se 1,25 µL de Proteinase K (50 µg/ µL) e 25 µL SDS 10% para
atingir uma concentração final de 0,5%), em seguida, as amostras foram incubadas por 1
hora em banho-maria a 56°C. Os demais procedimentos de extração foram realizados de
acordo com o método de extração com fenol-clorofórmio com algumas alterações
(Sambrook and Russel, 2001). Após isolamento dos ácidos nucleicos, as amostras foram
submetidas ao tratamento enzimático com as enzimas RNAse A e S1 nuclease, seguindo
as recomendações dos fabricantes.
2.2.7 Sequenciamento e análise preliminar dos genomas dos bacteriófagos
Para o sequenciamento dos genomas, um total de 2 µg de DNA purificado de
sete bacteriófagos foi usado para preparar as bibliotecas. O sequenciamento dos genomas
completos foi conduzido através de GridION X5 da Oxford Nanopore com FLOMIN106
(R 9.4.1) flowcells na "DNA Facility", Biotecnologia da Iowa State University, EUA. As
métricas do controle de qualidade das “reads” foram disponibilizadas utilizando a
ferramenta pycoQC (https://github.com/a-sl ide/pycoQC) a partir dos arquivos de
sumário do Guppy, e as montagens de longas “reads” foram conduzidas utilizando o
Canu, uma plataforma de montagem de contigs e scaffolds para conjunto de dados
derivados de tecnologias de sequenciamento da Oxford Nanopore. A busca preliminar
39
por similaridade utilizando os contigs montados, que provavelmente correspondem aos
genomas completos de cada isolado viral, foi realizada com a ferramenta BLAST do
NCBI.
2.2.8 Análise filogenética
A árvore filogenética foi construída usando sequências de aminoácidos proteína
principal do capsídeo (“Major capsid protein”) de membros de alguns gêneros da família
Myoviridae, Podoviridae, Autographiridae e Siphoviridae além dos sete bacteriófagos
que infectam Ralstonia spp. isolados no Espírito Santo. As sequências de nucleotídeos
das ORFs que codificam para a proteína capsidial foram extraídas do genoma de cada
bacteriófago exclusivamente para a análise filogenética através de uma anotação
preliminar (dados não mostrados). Os comprimentos dos ramos da árvore foram
dimensionados em termos da fórmula de distância intergenômica do da Genome BLAST
Distance Phylogeny (GBDP) baseadas em aminoácidos utilizando a plataforma VICTOR
(https://www.dsmz.de/services/online-tools/victor) (Meier-Kolthoff & Göker, 2017).
Comparações de topologias da árvore para checar congruência taxonômica em nível de
gênero foram feitas com base na classificação pelo VIRIDIC (Vírus Intergenomic
Distance Calculator).
2.3 Análises Estatísticas
Após análise crítica e tabulação dos resultados, os dados foram submetidos à
análise de variância (p≤0,05). Quando significativo, foram utilizados o teste de
comparação de médias de Skot-Knott, sendo as diferenças consideradas como
significativas quando p≤0,05 para os fatores qualitativos, e análise de regressão para os
fatores quantitativos. Os modelos foram escolhidos com base na significância dos
coeficientes de regressão, utilizando-se o teste t de student, ao nível de 5% de
probabilidade e pelo coeficiente de determinação pelo software estatístico SISVAR
https://www.dsmz.de/services/online-tools/victor
40
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Os isolados do CRS oriundos do ES pertencem à espécie Ralstonia solanacearum
Durante o desenvolvimento do trabalho foram realizadas 92 coletas de material
vegetal com e sem sintomas de murcha-bacteriana (Figura 1A), para obtenção de isolados
de espécies do CRS (Tabela suplementar S1). Após a prospecção de 17 amostras de
tomateiro, designadas pelo código SNR (amostragem não-randômica), em apenas sete
(S29-NR, S32-NR, S33-NR, S34-NR, S35-NR, S37-NR e S41-NR) foram detectados
isolados bacterianos que apresentaram semelhança com base em caracteres
morfoculturais que eram similares aos de isolados de espécies do CRS, todos associados
à plantas de tomateiro com sintomas de murcha-bacteriana (Figura 1B). A amostragem
não randômica indica que a amostragem foi direcionada à focos onde historicamente
houve relatos de incidência de murcha-bacteriana ou haviam plantas com sintomas típicos
da doença.
Dentre as características morfológicas, os isolados apresentavam colônias de
coloração branca, grandes, fluidas e que na presença de TTC (Cloreto Trifenil Tetrazol +
CPG), produzem o precipitado Formazan que marca o centro das colônias com uma
pontuação vermelha circundada pela coloração esbranquiçada, típica em isolados
virulentos do CRS (Figura 1B) (Garcia et al., 2019). Curiosamente, após a caracterização
genotípica através de Pmx-PCR, dos setes isolados obtidos, apenas cinco foram
confirmados como pertencentes ao CRS (Figura 1C).
O resultado dos dois isolados (B71 e B72) bacterianos que não pertenciam ao
CRS foi interpretado como falso positivo (Tabela suplementar S1; Figura 1C). Os
isolados confirmados foram depositados na Bacterioteca do LAVIB sob os códigos:
RsB67, RsB68, RsB69, RsB70-PC e RsB73, e foram classificados como pertencentes ao
filotipo II (espécie: Ralstonia solanacearum) conforme o perfil genotípico padrão do
isolado referência desse mesmo grupo taxonômico (CFBP2957), que apresenta uma
banda de 281 bp confirmando pertencer ao CRS e uma banda com comprimento de 372
pb, indicando pertencer ao filotipo II (Fegan & Prior, 2005).
Por meio do teste de patogenicidade (Figura 1D-F), observou-se que todos os
isolados inoculados causaram doença nas plantas de tomate cv. Bonne best, exceto o
isolado RsB70-PC (Figura 1G). Interessantemente na espécie Ralstonia solanacearum
41
ocorre um fenômeno conhecido como Conversão Fenotípica (“Phenotypic Conversion” -
PC) que ocorre devido à mutação no gene phcA que expressa um fator de transcrição
global que controla vários fatores de virulência, incluindo a produção de EPS (cápsula)
(Fegan & Prior, 2005).
A partir do sequenciamento e montagem do genoma do RsB70-PC, mapeou-se e
caracterizou-se essa mutação associada ao fenótipo de PC. Foi possível detectar uma
mutação do tipo “frameshift” (deleção/INDEL) na posição 24 do gene phcA que
provocou a alteração na fase de leitura da sequência codificadora (cds) com alta
penalidade para o produto desse gene, que passou a ser uma proteína truncada devido a
introdução de um stop códon prematuro (Figura suplementar S1).
O novo produto do gene phcA é um peptídeo putativamente não-funcional de apenas
sete aminoácidos, em contraste com o tamanho da proteína funcional presente em isolados
“selvagens” da mesma espécie (não mutantes) que tem em torno de 347 aminoácidos
(Kelman, 1954; Brumbley et al., 1993; Poussier, 2003). Essas informações são de extrema
importância, pois associada à deficiência na produção de cápsula, potencialmente este
isolado pode ter ampla utilização na detecção e propagação de bacteriófagos, caso
apresente um bom desempenho quanto à perfil de suscetibilidade, para ser explorado nas
etapas subsequentes. O acúmulo reduzido de material capsular durante os procedimentos
microbiológicos para prospecção de bacteriófagos é um atrativo em procedimentos de
filtragem viral para evitar saturação de membranas e rompimento de filtros durante
procedimentos de produção em larga escala.
3.2 Distintos solos do ES contém bacteriófagos líticos que infectam Ralstonia
solanacearum
Para prospecção de bacteriófagos, no campo foram coletadas um total de 92
amostras de solo e água (Tabela suplementar S1), que receberam códigos de acordo com
o tipo de amostragem, a saber, quando a prospecção não foi direcionada para áreas com
histórico de incidência de murcha-bacteriana, ou quando espécies não hospedeiras das
bactérias do CRS eram cultivadas na área, foram nomeadas com o código R (randômica),
42
e quando a amostragem foi direcionada a focos onde historicamente houve relatos de
incidência de murcha, nomeadas com o código NR (não randômica).
As amostras foram encaminhadas ao Laboratório de Virologia e Biocontrole de
Doenças de Plantas (LAVIB) para prospecção de bacteriófagos. Apenas as amostras
(S29-NR, S30-NR, S31-NR, S32-NR, S33-NR, S34-NR, S35-NR, S36-NR, S38-NR S41-
NR), oriundas das cidades de Venda Nova do Imigrante-ES e Afonso Claudio-ES,
apresentaram atividade lítica no ensaio de Spot test com CPG sobrecamada utilizando R.
solanacearum RsB70-PC como isolado isca (Figura 2A-B). Após a detecção de atividade
lítica nas amostras (Figura 2B), os bacteriófagos foram isolados através de três sucessivos
ciclos de purificação biológica (Figura 2C) antes das propagações (Figura 2D) para
garantir que as suspensões dos isolados virais estivessem livres de contaminações
cruzadas com outros bacteriófagos.
Os bacteriófagos identificados neste trabalho receberam sua identificação em
homenagem a líderes e princesas de origem africana escravizados em terras capixabas,
quilombolas, povos originários, como os Krenak (Botocudos) e lideranças femininas ao
longo da história do Espírito Santo (Paraíso, 1992; Araújo, 1996; Cardoso, 2008; Oliveira,
2012; Maciel, 2016; Giorgis, 2017), coube a equipe envolvida nessa pesquisa, nomear
orgulhosamente os oito bacteriófagos isolados como: Phage Zacimba, Phage Laurinda,
Phage Ortiz, Phage Kapixawa, Phage Krenak, Phage Zilma, Phage Elisiario e Phage
Canuta.
A diversidade morfológica das placas de lise que possuem diâmetro variando
entre 1.5-2.4 mm é pequena (Figura 3A) porém os bacteriófagos puderam ser agrupados
em três grupos de agressividade com base em observações rotineiras quanto à velocidade
e magnitude lítica de cada vírus. O bacteriófago Phage Laurinda apresentou Baixa
43
agressividade, os bacteriófagos Phages Elisiario, Zacimba, Zilma e Canuta apresentaram
agressividade Moderada e os bacteriófagos Phages Ortiz, Kapixawa e Krenak
apresentaram agressividade Alta. Adicionalmente, a robustez da atividade lítica pode ser
observada para os oito bacteriófagos quando inoculados em tubos de ensaio contendo a
suspensão bacteriana de R. solanacearum RsB70-PC, indicando a efetividade para reduzir
o inóculo bacteriano (Figura 3B).
3.3 Bacteriófagos líticos oriundos do ES apresentam distintos perfis de
agressividade
O estudo da cinética de infecção dos oito bacteriófagos isolados permitiu acessar
as perturbações na curva de crescimento de Ralstonia solanacearum RsB70-PC horas
pós-infecção (hpi) com cada bacteriófago isoladamente. Nas primeiras 5 hpi, quando a
intensa atividade de síntese foi perceptível na curva de crescimento bacteriana (fase log)
(Figura 4A), diferenças significativas no perfil de agressividade viral possibilitaram
consistentemente confirmar as observações anteriores quanto a classificação dos
bacteriófagos em 3 grupos (Figura 3A; Figura 4B). O agrupamento quanto aos perfis de
agressividade foi baseado na magnitude lítica viral, quantificando o declínio da densidade
óptica das culturas bacterianas de R. solanacearum RsB70-PC inoculadas com os oito
bacteriófagos nos períodos 0, 5 e 10 hpi. A magnitude lítica viral neste estudo foi
mensurada conforme a capacidade de induzir o declínio das unidades de densidade óptica
durante a fase exponencial do crescimento bacteriano (Figura 4) e as equações de
regressão obtidas foram utilizadas para descrever o comportamento do fenômeno da
cinética das infecções virais ao longo do tempo, assim como determinar valores
específicos das variáveis de interesse. O bacteriófago: Phage Laurinda pertence ao grupo
de agressividade baixa, os bacteriófagos: Phages Elisiario, Zacimba, Zilma e Canuta
44
pertencem ao grupo dos virus com agressividade moderada e por fim, os bacteriófagos:
Phages Ortiz, Kapixawa e Krenak, pertencem ao grupo viral que apresenta agressividade
alta.
Os oito bacteriófagos apresentam potencial para o controle biológico e manejo da
murcha-bacteriana, pois podem causam lise celular no hospedeiro, reduzindo o inóculo
no sistema, como visto para outros bacteriófagos capazes de infectar Ralstonia
solanacearum (Yamada et al. 2007) e outras bactérias fitopatogênicas como Xillella
fastidiosa (Ahern, et al. 2014) e Xanthomonas axonopodis pv. citri (Ahmad et al. 2014b,
Ahmad et al. 2014a).
3.4 Bacteriófagos oriundos do ES infectam isolados das espécies R. solanacearum e R.
pseudosolanacearum e possuem mecanismos de infecção contrastantes
A gama de hospedeiros foi investigada utilizando um painel genético
diversificado de isolados mundiais do CRS além de outras espécies de bactérias
fitopatogênicas ou promotoras de crescimento (Tabela 1). Conforme a Tabela 2, alguns
isolados dos filotipos I e II pertencentes ao CRS foram suscetíveis a infecção pelos oito
bacteriófagos, havendo grupos de isolados suscetíveis (S) e resistentes (R). A maioria dos
isolados do CRS de outros países se comportou como resistente ou como moderadamente
suscetível e nenhum isolado do filotipo IV ou III foi infectado.
Distintos fenótipos resultantes das combinações vírus-bactéria foram observadas
e classificados como subtipos, para resposta de resistência, foram observados: RNH
(NH=Non-host), quando não houve detecção de zonas de lise independente da suspensão
viral inoculada (107, 106 e 105 UFP/mL-1) e a reação bacteriana a infecção viral foi do
tipo resistência de bactéria não-hospedeira ou RA (A=Altruism), quando a lise bacteriana
45
foi detectada apenas pós-inoculação da suspensão viral de alto título (107 UFP/mL-1), não
havendo transição fenotípica coerente de intensidade de lise com inóculos mais baixos,
como ocorre em reações de suscetibilidade. Nesse fenótipo, provavelmente algum
mecanismo de resistência inata atua sob um controle comportamental altruísta (Figura
suplementar S2). Um total de três subtipos foram verificados para a resposta de
suscetibilidade, sendo S, presença de placas de lise quando as três suspensões virais com
títulos distintos (107, 106 e 105 UFP/mL-1) foram inoculados, porém a intensidade da lise
foi título viral-dependente; SM (M=Moderate), presença de placas de lise apenas quando
as suspensões virais com títulos mais altos (107, 106 UFP/mL-1) foram inoculadas; SH
(H=Higly), presença de placas de lise quando as suspensões virais com distintos títulos
(107, 106 e 105 UFP/mL-1) foram inoculados, porém a intensidade da lise foi extremamente
forte e ocorrendo de maneira independente do título viral (Tabela 2; Figura Suplementar
S2).
A diversidade das respostas de suscetibilidade e resistência foi bacteriófago-
dependente, indicando que os oito bacteriófagos provavelmente apresentam divergências,
ainda que mínimas quanto aos mecanismos de patogênese viral. Os bacteriófagos foram
mais agressivos contra isolados brasileiros de R. solanacearum, especificamente aqueles
oriundos do Espirito Santo, isolados RsB67, RsB68, RsB69, RsB70-PC e RsB73, que
apresentaram resposta de suscetibilidade SH (Tabela 2; Figura Suplementar S2). Essa
reação para o grupo de isolados oriundos do mesmo município reflete possivelmente um
caso clássico de co-evolução vírus-bactéria.
Embora exista especificidade dos bacteriófagos para Ralstonia spp., novas
espécies descritas de bacteriófagos líticos da família Myoviridae tem ampla gama de
hospedeiros, infectando não apenas espécies de Ralstonia spp., mas também cepas de
Burkholderia glumae e Burkholderia plantarii tornando-os especialmente vantajosos para
46
o biocontrole de várias fitobacterioses em culturas economicamente importantes (Ahmad
et al. 2021, Sasaki et al. 2021).
3.5 Bacteriófagos oriundos do ES possuem material genético composto por DNA
de fita dupla
Constatou-se que a molécula genômica de pelo menos sete bacteriófagos é DNA
de fita dupla (dsDNA) após os tratamentos com as endonucleases específicas DNAse,
RNAse e S1 nuclease. O material genético foi resistente ao tratamento com RNAse e S1
nuclease, que degradam moléculas de RNA e ssRNA, respectivamente, porém foi
passível de degradação quando a enzima DNAse foi adicionada ao sistema, indicando a
natureza bioquímica do ácido nucleico (dados não mostrados). Apenas para o Phage
Zacimba não foi possível avançar nas análises genômicas, pois curiosamente o seu
material genético não pôde ser recuperado após tentativas exaustivas utilizando os
protocolos disponíveis, sendo necessária futuramente uma investigação mais aprofundada
acerca das propriedades desse isolado viral. Após a caracterização dos ácidos nucleicos
virais, foi possível constatar que todos os sete bacteriófagos pertencem à ordem
Caudovirales que abriga as famílias de bacteriófagos caudados com genoma de dsDNA
(Ackermann, 2007).
3.6 Bacteriófagos oriundos do ES são isolados de uma putativa nova espécie
relacionada aos taxa do gênero Bakolyvirus (Família: Myoviridae)
Para avançar o entendimento sobre as características genotípicas e
posicionamento taxonômico dos sete bacteriófagos, o genoma foi completo foi
47
sequenciado e os tamanhos dos contigs genômicos montados e trimados foi de
aproximadamente 46.000 pb e apresentam conteúdo GC% variando na faixa de 62.92-
63.18%, muito próximo aos valores médios para o cromossomo (66,6%) e
megaplasmídeo (66,7%) de Ralstonia solanacearum (Xu et al., 2011) (Tabela 3). A
análise de BLASTn dos sete genomas contra o banco de sequências virais da plataforma
NCBI nos leva a concluir que esses bacteriófagos pertencem a família Myoviridae, pois
apresentam identidade nucleotídica variando de 80.96-82.03% com a espécie Ralstonia
phage Simangalove, um táxon do gênero Bakolyvirus (Família: Myoviridae) com
tamanho de genoma (Tabela 3). Os valores de identidade abaixo de 95%, com base em
sequência de nucleotídeos do genoma completo, suportam a proposição de pelo menos
uma nova espécie, porém, análises complementares deverão ser conduzidas antes do
envio da proposta ao ICTV. Todos os sete genomas apresentaram uma alta similaridade
nucleotídica entre si, sendo estreitamente relacionados ao nível médio de 97,99% de
similaridade, o que fortemente sugere que se tratam de isolados de uma única espécie
viral ainda não descrita (Tabela 4).
A análise filogenética usando sequências da proteína principal do capsídeo de
alguns taxa das famílias Myoviridae, Siphoviridae, Autographiridae e Podoviridae
incluindo membros do gênero mais relacionado, com base em resultados anteriores,
Bakolyvirus da família Myoviridae e dos sete bacteriófagos que infectam Ralstonia spp.,
confirmou a hipótese de que os sete bacteriófagos são mais relacionados aos bacteriófagos
do clado Bakolyvirus, formando um subclado (Figura 5). A família Myoviridae inclui
vírus com um genoma de dsDNA (31 a 317 kbp), cabeça icosaédrica e uma longa cauda
contráctil (Ackermann & Prangishvili, 2012). De acordo com o ICTV (2022) a família
Myoviridae apresenta atualmente 8 subfamílias e 153 gêneros
(https://talk.ictvonline.org/taxonomy/). Trabalhos recentes demonstram a importância de
48
inúmeros bacteriófagos dessa família no controle de bactérias fitopatogênicas (Ahmad et
al. 2021, Sasaki et al. 2021, Deng et al. 2021, Addy et al. 2019, Narulita et al. 2016).
Nesse trabalho foram isolados e caracterizados a nível genômico sete
bacteriófagos (isolados Canuta, Krenak, Zilma, Elisiario, Laurinda, Kapixawa e Ortiz)
possivelmente pertencentes a uma nova espécie, provisoriamente proposta como
Ralstonia phage Kapixawa da família Myoviridae, relacionada aos taxa do gênero
Bakolyvirus, com potencial para biocontrole de Ralstonia solanacearum, agente causal
da murcha-bacteriana em diversas culturas economicamente importantes.
4. CONFLITO DE INTERESSES
Nenhum potencial conflito de interesses foi relatado para este artigo.
5. AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior- CAPES, visto que “o presente trabalho foi realizado com apoio da
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) -
Código de Financiamento 001.” e à Fundação de Amparo à Pesquisa e Inovação do
Espírito Santo-FAPES pelo suporte financeiro. Ao Laboratório de Virologia e
Biocontrole de Doenças de Plantas (LAVIB/Ufes) e o Núcleo de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico em Manejo Fitossanitário de Pragas e Doenças
(NUDEMAFI/Ufes) pelo espaço físico. À Universidade Federal Rural de Pernambuco
(UFRPE) pelo fornecimento dos isolados brasileiros de Ralstonia spp., constante
parceria e apoio financeiro. E por fim, à University of Wisconsin-Madison, Madison,
USA, pelo fornecimento dos isolados internacionais de Ralstonia spp., estrutura física e
apoio financeiro.
49
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53
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Com base no levantamento realizado neste trabalho, constatou-se que a Região
Serrana do Estado do Espírito Santo, onde se concentra o Pólo Produtor de hortaliças e
agricultura familiar, possui ampla diversidade viral que pode ser acessada e caracterizada.
As amostras coletadas na Região Serrana possuem bacteriófagos líticos (Phage
Zacimba, Phage Ortiz, Phage Elisiario, Phage Zilma, Phage Krenak, Phage Kapixawa,
Phage Canuta e Phage Laurinda), com diferentes características biológicas, fenotípicas e
genéticas. Esses bacteriófagos possuem a capacidade de infectar diferentes isolados do
complexo Ralstonia solanacearum (CRS) de origem local e mundial. Além disso, os
novos vírus possuem diferentes padrões de magnitude viral, quando inoculados no isolado
Ralstonia solanacearum RsB70-PC.
Considerando que houve resposta de resistência/suscetibilidade variada no painel
de isolados bacterianos do CRS submetidos à inoculação com os oito bacteriófagos
testados, a proposta de um coquetel viral que contempla os diferentes mecanismos de
patogênese viral torna-se interessante para fins de manejo da resistência antiviral nas
populações do patógeno no campo.
A ausência de agrotóxicos ou produtos biológicos registrados no Brasil para o
manejo da murcha-bacteriana projeta os novos vírus líticos identificados nesse trabalho
como uma proposta inovadora e de baixo custo, para produção de coquetéis de
bacteriófagos virulentos no controle dessas bactérias fitopatogênicas.
54
TABELAS
Tabela 1: Informações sobre isolados de espécies do Complexo Ralstonia solanacearum (CRS) e outras espécies bacterianas, incluindo
fitopatogênicas e promotoras de crescimento vegeta