1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA WEVERTON PEREIRA DE MEDEIROS ESTUDOS SOBRE A DIFERENCIAÇÃO DE SINAIS TRANSITÓRIOS DE FLUORESCÊNCIA DA CLOROFILA a EM PLANTAS DE MAMOEIRO COM E SEM SINTOMAS NA PRESENÇA DOS VÍRUS PRSV-P E PMEV VITÓRIA, ES 2025 2 WEVERTON PEREIRA DE MEDEIROS ESTUDOS SOBRE A DIFERENCIAÇÃO DE SINAIS TRANSITÓRIOS DE FLUORESCÊNCIA DA CLOROFILA a EM PLANTAS DE MAMOEIRO COM E SEM SINTOMAS NA PRESENÇA DOS VÍRUS PRSV-P E PMEV Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Biotecnologia do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Biotecnologia. Orientadora: Profa. Dra. Diolina Moura Silva VITÓRIA, ES 2025 3 Ficha catalográfica disponibilizada pelo Sistema Integrado de Bibliotecas - SIBI/UFES e elaborada pelo autor M488e Medeiros, Weverton Pereira de, 1994- MedESTUDOS SOBRE A DIFERENCIAÇÃO DE SINAIS TRANSITÓRIOS DE FLUORESCÊNCIA DA CLOROFILA a EM PLANTAS DE MAMOEIRO COM E SEM SINTOMAS NA PRESENÇA DOS VÍRUS PRSV-P E PMEV / Weverton Pereira de Medeiros. - 2025. Med51 f. : il. MedOrientadora: Diolina Moura Silva. MedTese (Doutorado em Biotecnologia) - Universidade Federal do Espírito Santo, Centro de Ciências da Saúde. Med1. Vírus da mancha anelar do mamoeiro. 2. doença da meleira. 3. fluorescência da clorofila a. 4. coinfecção; análise não destrutiva. I. Silva, Diolina Moura. II. Universidade Federal do Espírito Santo. Centro de Ciências da Saúde. III. Título. CDU: 61 5 WEVERTON PEREIRA DE MEDEIROS ESTUDOS SOBRE A DIFERENCIAÇÃO DE SINAIS TRANSITÓRIOS DE FLUORESCÊNCIA DA CLOROFILA a EM PLANTAS DE MAMOEIRO COM E SEM SINTOMAS NA PRESENÇA DOS VÍRUS PRSV-P E PMEV Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Biotecnologia do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Biotecnologia. Em 30 de outubro de 2025. Profa. Dra. Diolina Moura Silva Universidade Federal do Espírito Santo- Orientadora Prof. Dra. Sônia Alves Gouvea Universidade Federal do Espírito Santo - Membro Interno Prof. Dra. Flavia de Paula Universidade Federal do Espírito Santo - Membro Interno Prof. Dr. Lucas Cavalcante da Costa Universidade Federal Rural da Amazônia - Membro Externo Prof. Dr. Vitor de Laia Nascimento Universidade Federal de Lavras - Membro Externo VITÓRIA, ES 2025 6 DEDICATÓRIA Dedico este trabalho a todos que acreditam na força dos sonhos e na importância de nunca desistir. Que a paciência, a perseverança e a resiliência sejam sempre luz no caminho, mesmo diante das dificuldades. Este é o resultado de um percurso guiado pela fé, pelo esforço constante e pela certeza de que cada desafio nos torna mais fortes. 7 AGRADECIMENTOS A Deus, por me conceder força, sabedoria e serenidade para concluir esta etapa da minha vida. À Universidade Federal do Espírito Santo (UFES), em especial ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia (PPGBiotec-UFES), pela oportunidade de formação e aprendizado. Ao Núcleo de Estudos da Fotossíntese (NEF) e ao Laboratório de Biotecnologia Aplicada ao Agronegócio (LBAA), pela estrutura, apoio técnico e pelo ambiente de pesquisa que tornaram possível a realização deste trabalho. À Professora Dra. Diolina Moura Silva, pela orientação, e dedicação durante todo o desenvolvimento desta pesquisa. Aos membros da banca avaliadora, pelo gentil aceite e pelas valiosas contribuições. Ao Prof. José Aires Ventura, pela colaboração e pelo incentivo constante ao longo desses anos, e a todo o corpo docente do PPGBiotec, pelo compartilhamento de conhecimento e experiências que contribuíram para minha formação. À Dra. Sabrina Broetto, Dr. Oeber Quadros, Dra. Thaís Gasparini e Dra. Mariela Mattos, pela contribuição científica e pela parceria durante o desenvolvimento da pesquisa. Aos colegas de laboratório do NEF e aos integrantes do Projeto PMBA Projeto de Monitoramento de Biodiversidade Aquática, bem como aos amigos do NTI/FEST, pela amizade, cooperação e troca de conhecimento ao longo dessa jornada. Às minhas mães, Marli Dantas de Araújo e Marilene Pereira de Medeiros, por todo amor, apoio e incentivo incondicional. Aos meus amigos Joellington Marinho, Isabella Brito e Júlia Merchan, pela presença e companheirismo em todos os momentos. Às agências de fomento CNPq, CAPES e FAPES, pelo apoio financeiro e institucional à realização deste trabalho, e à Fundação Espírito-Santense de Tecnologia (FEST), pelo suporte concedido. 8 ESTRUTURA DA TESE Os resultados obtidos neste trabalho de tese estão apresentados em formato de artigo publicado em Plants (CAPES: MB, JCR: Q1, SJR: Q1, FI 4.1, Citescore: 7.6). MEDEIROS, W. P.; QUADROS, O. F.; BROETTO, S. G.; VENTURA, J. A.; SILVA, D. M. Studies on the differentiation of transient chlorophyll a fluorescence signals in papaya plants showing symptoms and without symptoms in the presence of PRSV-P and PMeV viruses. Plants, v. 14, n. 3208, 2025. DOI: https://doi.org/10.3390/plants1420320 9 a; RESUMO MEDEIROS, W. P. Estudos sobre a diferenciação de sinais transitórios de fluorescência da clorofila a em plantas de mamoeiro com e sem sintomas na presença dos vírus PRSV-P e PMeV. 2025. 66f. Tese (Doutorado em Biotecnologia) Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, UFES, Espírito Santo. Brasil. Infecções virais representam uma ameaça crítica às espécies de plantas cultivadas. No cultivo de mamão, duas doenças virais mosaico do mamão (causada pelo vírus da mancha anelar do mamão tipo P PRSV-P) e doença pegajosa do mamão (causada por um complexo viral do vírus da meleira do mamão PMeV e do vírus da meleira do mamão PMeV2) são prevalentes e capazes de devastar plantações inteiras, incorrendo em perdas econômicas substanciais. As práticas atuais de diagnóstico dependem da identificação visual dos sintomas e da eliminação de plantas infectadas (roguing). O monitoramento da eficiência fotossintética em pomares propensos à coinfecção por PRSV-P e PMeV2 pode permitir uma intervenção precoce, mitigando perdas de produtividade e reduzindo a qualidade dos frutos. Este estudo teve como objetivo avaliar a fluorescência da clorofila a como um biomarcador para comprometimento fotossintético e severidade dos sintomas em mamão infectado com PRSV-P e/ou PMeV2 e explorar a viabilidade da detecção precoce da infecção por esses patógenos duplos, como um estudo exploratório em condições de campo. A fluorescência da clorofila a revelou detalhes sobre a fisiologia de plantas coinfectadas com o complexo de PMeV2 e PRSV-P: a força motriz eletrônica dentro do fotossistema II (FSII) diminui em plantas infectadas e naquelas sem sintomas visuais de infecção, sendo proporcional à idade e ao estágio de desenvolvimento das plantas. Uma desaceleração na rotatividade de transferência de múltiplos elétrons do FSII e uma diminuição na eficiência das reações redox do fotossistema I foram observadas em plantas com ou sem detecção visual da infecção. As evidências geradas sugerem que a técnica de fluorescência da clorofila a pode ser usada para monitorar o estado fisiopatológico de plantas sob estresse biótico. Palavras-chave: Vírus da mancha anelar do mamoeiro; doença da meleir fluorescência da clorofila a; coinfecção; análise não destrutiva. 10 ABSTRACT MEDEIROS, W.P. Studies on the differentiation of transient chlorophyll a fluorescence signals in papaya plants showing symptoms and without symptoms in the presence of PRSV-P and PMeV viruses. 66f. Thesis (Doctorate in Biotechnology) Graduate Program in Biotechnology, UFES, Espírito Santo, Brazil. Viral infections represent a critical threat to cultivated plant species. In papaya cultivation, two viral diseases - papaya mosaic (caused by papaya ringspot virus type- P (PRSV-P) and papaya sticky disease (caused by a virus complex of papaya meleira virus - PMeV, and papaya meleira virus - PMeV2) - are prevalent and capable of devastating entire plantations, incurring substantial economic losses. Current diagnostic practices rely on visual identification of symptoms and elimination of infected plants (rouging). Monitoring photosynthetic efficiency in orchards prone to PRSV-P and PMeV2 coinfection may allow early intervention, mitigate productivity losses and reducing fruit quality. This study aimed to evaluate chlorophyll a fluorescence as a biomarker for photosynthetic impairment and symptom severity in papaya infected with PRSV-P and/or PMeV2 and to explore the feasibility of early detection of the infection by these dual pathogens, as an exploratory study under field conditions. Chlorophyll, a fluorescence revealed details about the physiology of plants coinfected with the complex of PMeV2 and PRSV-P: the electron motive force within PSII decreases in infected plants and in those without visual symptoms of infection, being proportional to the age and developmental stage of the plants. A slowdown in the multiple electron transfer turnover of PSII and a decrease in the efficiency of the redox reactions of photosystem I observed in plants with or without visual detection of infection. The evidence generated suggests that the chlorophyll a fluorescence technique, can be used to monitor the pathophysiological state of plants under biotic stress. Keywords: Papaya ringspot vírus; sticky disease; chlorophyll a fluorescence; co- infection; non-destructive analysis. 11 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Produção estimada de mamão (Carica papaya) nos principais países exportadores, Brasil, Guatemala, Malásia e México, entre os anos de 2020 a 2024. Os dados estão expressos em toneladas (t) e evidenciam o predomínio do México como maior exportador mundial, seguido por Guatemala e Brasil. Observando-se estabilidade na produção brasileira e declínio gradual nas exportações da Guatemala e da Malásia ao longo do período analisado ............................................................. 17 Figura 2. Organização genômica dos vírus da meleira do mamoeiro. PMeV: ORF1 decodifica a proteína capsidial (CP) (1.563 aa) e ORF2 codifica a RNA polimerase dependente de RNA (RdRp) (1.147 aa); PMeV2: ORF1 codifica uma proteína hipotética (270 aa) e ORF2 codifica a RdRp (473 aa) ............................................... 22 Figura 3. Sintomatologia da meleira do mamoeiro em plantas no campo. A) Pontas de folhas jovens queimadas; B) Exsudação livre e espontânea do látex e manchas necróticas em frutos de mamão resultado da oxidação do látex em contato com ar; C, D e E) Látex fluído ..................................................................................................... 19 Figura 4. Organização genômica do vírus PSFaV com duas ORFs em sua estrutura, a ORF1 entre os nucleotídeos 743 e 5518, responsável pela codificação das proteínas estruturais da proteína capsidial (CP) e a ORF2 entre os nucleotídeos 5800 e 9163, responsável pela codificação das proteínas estruturais da proteína capsidial (CP) e a ORF2 entre os nucleotídeos 5800 e 9163, responsável pela codificação de uma RNA polimerase dependente de RNA (RdRp). PpVQ possui duas ORFs em sua estrutura, a ORF1 entre os nucleotídeos 9 e 995, responsável pela codificação de uma proteína putativa e a ORF2 entre os nucleotídeos 995 e 2575, responsável pela codificação de uma RNA polimerase dependente de RNA (RdRp) .................................................. 20 Figura 5. Sintomas característicos do vírus da mancha anelar do mamoeiro P). (a) Folha apresentando severa distorção e mosaico devido à infecção vira Fruto exibindo manchas anelares típicas causadas pelo vírus...........................................21 12 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................ 13 1.1 JUSTIFICATIVA ............................................................................................. 15 2 OBJETIVOS .................................................................................................. 16 2.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................ 16 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................... 16 3 FUNDAMENTAÇÃO TÉORICA .................................................................... 17 3.1 CULTURA DO MAMOEIRO .......................................................................... 17 3.2 VÍRUS DA MELEIRA DO MAMOEIRO E MOSAICO ..................................... 18 3.2.1 Vírus da meleira do mamoeiro no Brasil e sua dimensão pelo mundo ....... 18 3.2.2 Vírus do mosaico ........................................................................................ 21 3.3 RELAÇÃO VÍRUS-PLANTA NA VIA FOTOSSINTÉTICA .............................. 22 3.3.1 Fotossíntese no mamoeiro em condições de estresse ......................... 24 4. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................... 25 4.1. Área experimental e material vegetal ......................................................... 25 4.2. Fluorescência transitória da clorofila a ........................................................ 26 4.3. Índice de clorofila ........................................................................................ 26 4.4. Diagnóstico molecular ................................................................................. 26 4.5. Delineamento experimental e análise estatística ........................................ 27 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................... 27 1. Introduction .................................................................................................... 28 2. Results ........................................................................................................... 31 3. Discussion ...................................................................................................... 36 4. Materials and Methods ................................................................................... 39 5. Conclusions .................................................................................................... 41 References ......................................................................................................... 41 6. CONCLUSÃO ..................................................................................................... 48 REFERÊNCIAS .................................................................................................... 49 13 1 INTRODUÇÃO O mamoeiro (Carica papaya L.) é uma das principais frutíferas cultivadas no Brasil, o qual ocupa lugar de destaque entre os maiores produtores mundiais juntamente com Índia, México e República Dominicana (EMBRAPA, 2021). O Brasil ocupa uma posição de destaque no cenário internacional como o segundo maior produtor de mamão. De acordo com a FAO (2024) o Brasil aumentou em cerca de 18% sua produção de mamão no ano de 2024. O cultivo do mamoeiro ocorre em praticamente todos os estados brasileiros, sendo as regiões Sudeste e Nordeste os principais polos de produção. Os estados mais importantes na produção de mamão são Bahia e Espírito Santo, que juntos respondem por cerca de 70% da produção nacional, seguidos por Ceará, Minas Gerais, Paraíba e Rio Grande do Norte (IBGE, 2020). Sendo notória a importância socioeconômica da cultura do mamoeiro na geração de empregos no setor agroindustrial (Galeano, 2022). Uma vez que o Brasil é um dos principais produtores da cultura do mamoeiro, aprimorar os conhecimentos sobre a implicação das condições ambientais, geográficas e de estresse, podem auxiliar no manejo da cultura e no seu rendimento. Neste contexto, uma das formas de verificar mudanças fisiológicas na planta é investigando a eficiência do aparato fotossintético. Estudos já demonstram que durante o desenvolvimento vegetal, plantas de C. papaya quando condicionadas à condição de estresse sofrem modificações no cloroplasto e na fotossíntese, provocando alterações na produção de biomassa (Chen; Cheng, 2009; Camargo, 2010; Gonçalves et al., 2010). O estresse pode ser ocasionado de forma biótica e/ou abiótica. Entretanto, sabe-se que a principal causa de perdas de lavouras de mamoeiro é ocasionada por doenças por virus, como a doença da meleira do mamoeiro e do mosaico. A presença para eliminação das plantas doentes, acarretando prejuízos econômicos aos produtores. A doença da meleira é provocada pelo complexo viral Papaya Meleira Virus (PMeV e PMeV2), no qual as plantas permanecem assintomáticas no campo durante o período da pré-floração, vindo a apresentar os sintomas da doença na pós-floração (Antunes et al., 2020). Enquanto, o mosaico é oriundo do Papaya ringspot virus P (PRSV-P), provocando manchas anelares no fruto (Gonsalves et al., 2010). Ambos os vírus podem estar presentes em concomitância nas plantações de 14 mamão tornando os sintomas das doenças mais graves. Assim, no Brasil, o monitoramento dos pomares ocorre semanalmente visando o controle fitossanitário da doença no campo (Ventura et al., 2003). Entretanto, mesmo com o controle rigoroso a doença pode levar à perda de 20% da plantação ou em casos mais severos de toda a sua erradicação (Antunes et al., 2020). O complexo PMeV pode provocar o inchaço das células através do processo de turgescência celular, levando a uma maior exsudação de látex que em contato com o ar ocasiona manchas necróticas nos frutos de mamoeiro (Antunes et al., 2016; Antunes et al., 2020). Já, a presença do PRSV pode acarretar danos foliares, tais nos frutos (Gonsalves et al., 2010). A implicação celular nas plantas de C. papaya pelos vírus do complexo PMeV e PRSV pode provocar danos ao aparato fotossintético, comprometendo o desenvolvimento vegetativo e reprodutivo. O comprometimento das vias fotossintéticas que envolvem o fotossistema II (FSII) e o fotossistema I (FSI) podem provocar danos durante o desenvolvimento da planta (Provvidenti, 1996; Bower et al., 2002). A compreensão das modificações provocadas pelo virus no aparato fotossintético da planta poderá contribuir para a identificação de parâmetros que auxiliem na identificação precoce da doença (Giehl et al., 2008). Neste sentido, identificar as alterações no mecanismo fisiológico em cultivares de plantas do mamoeiro infectadas e não infectadas se torna de grande interesse do ponto de vista agroeconômico, possibilitando menores perdas para a agricultura e uma melhor qualidade do produto final obtido (Kalaji et al., 2011). A possibilidade de verificar a eficiência fotossintética em plantas de C. papaya. durante o seu desenvolvimento em pomares com relatos da doença da meleira e do mosaico do mamoeiro, podem auxiliar a desvendar mecanismos da infecção viral. Além de encontrar padrões da via fotossintética de mamoeiros que conduzem à identificação precoce da doença no campo. A implementação de técnicas usando a fluorescência da clorofila a pode tornar possível o melhor entendimento da interação planta-ambiente. 15 1.1 JUSTIFICATIVA O mamoeiro (Carica papaya L.) é uma das frutas mais cultivadas e comercializadas no Brasil, com grande importância econômica e social para os produtores, especialmente nas regiões Nordeste e Sudeste. Apesar de sua relevância, a cultura enfrenta sérios desafios devido à ocorrência de doenças virais, que comprometem significativamente a produtividade e a qualidade dos frutos. Entre as principais enfermidades estão o mosaico, causado pelo Papaya ringspot virus-P (PRSV-P), e a meleira, provocada pelo complexo viral Papaya Meleira Virus (PMeV e PMeV2). Essas doenças têm causado grandes prejuízos à fruticultura, podendo resultar em perdas de até 85% da produção em áreas severamente afetadas. O controle dessas viroses ainda é um desafio, já que não existe tratamento curativo. As medidas preventivas, como o arranquio de plantas com sintomas visuais (roguing), dependem da percepção humana e, muitas vezes, não são eficazes na identificação de infecções iniciais. Esse cenário demonstra a necessidade de estudos que permitam compreender melhor os efeitos das infecções virais sobre a fisiologia da planta e que contribuam para o desenvolvimento de métodos de diagnóstico mais rápidos e precisos. A fotossíntese é um dos processos mais sensíveis a estresses bióticos e a análise da fluorescência da clorofila a tem se mostrado uma ferramenta eficiente para detectar alterações no aparato fotossintético antes mesmo da manifestação de sintomas visíveis. Assim, a avaliação da eficiência fotoquímica pode fornecer informações valiosas sobre o impacto das doenças virais no desempenho fisiológico do mamoeiro, auxiliando na detecção precoce e na compreensão dos mecanismos de resposta da planta ao estresse. Dessa forma, este estudo se justifica pela importância de aprofundar o conhecimento sobre as alterações fisiológicas causadas pelas infecções virais em mamoeiros e pelo potencial de aplicação prática dessa abordagem no monitoramento e manejo das doenças. Os resultados obtidos contribuem para a melhoria das estratégias de controle, além de, reduzir as perdas econômicas e fortalecer a sustentabilidade da produção de mamão no Brasil. 16 2 OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL Utilizar a fluorescência da clorofila a como ferramenta para avaliar a perda de eficiência fotossintética e a severidade dos sintomas em tecidos fotossintetizantes infectados pelo vírus do mosaico (PRSV-P) e pelo complexo viral (PMeV e PMeV2) da meleira do mamoeiro e explorar a possibilidade de detectar as alterações fisiológicas induzidas por ambas as viroses em plantações de mamoeiro. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Quantificar os teores de pigmentos e de Nitrogênio em folhas do mamoeiro quando infectadas pelo vírus do mosaico (PRSV-P) e pelo complexo viral (PMeV e PMeV2) da meleira do mamoeiro; Analisar o efeito da infecção do PRSV-P sobre a atividade fotoquímica de folhas do mamoeiro usando a fluorescência transiente da clorofila a como método indicador; Analisar o efeito da infecção do complexo viral PMeV sobre a atividade fotoquímica de folhas do mamoeiro usando a fluorescência transiente da clorofila a como método indicador. 17 3 FUNDAMENTAÇÃO TÉORICA 3.1 CULTURA DO MAMOEIRO C. papaya é uma fruta tropical altamente consumida no Brasil e em outros países, podendo ser encontrada em feiras públicas e em mercados. O Brasil exportou cerca de 45 mil toneladas em 2024, com um crescimento aproximado de 18% no mesmo ano (FAO, 2024). Os dados preliminares da FAO demonstraram um aumento de 1% na exportação mundial de mamão desde 2022, decorrente de uma queda na produção entre os anos de 2020 e 2021 (FAO, 2023). Entretanto, desde os anos 2000 tem sido observado um declínio na produção do fruto no Brasil decorrente da perda de área plantada e sua exportação, apesar de um aumento de sua produção em nível mundial de acordo com a FAO (2024) (Figura 1). Segundo dados da FAO e do Ministério da Agricultura e Pecuária (MAPA)(2023) as projeções são de aumento de 1,9% por ano até 2032 alcançando uma produção de 18 milhões de toneladas. Existem esforços para o aprimoramento da cultura do mamoeiro em diversos estados produtores no Brasil, em especial no Espírito Santo, com a necessidade de novas tecnologias de pós-colheita e novos modelos de gestão dentro da agroindústria (Galeano et al., 2022). Figura 1. Produção estimada de mamão (Carica papaya) nos principais países exportadores, Brasil, Guatemala, Malásia e México, entre os anos de 2020 a 2024. Os dados estão expressos em toneladas (t) e evidenciam o predomínio do México como maior exportador mundial, seguido por Guatemala e Brasil. Observando-se estabilidade na produção brasileira e declínio gradual nas exportações da Guatemala e da Malásia ao longo do período analisado. Fonte: FAO (2024). 18 As regiões nordeste e sudeste do Brasil concentram entre os estados da Bahia e Espírito Santo cerca de 70% da produção nacional de mamão, acompanhados do Ceará, Minas Gerais, Paraíba e Rio Grande do Norte (IBGE, 2020). Segundo Galeano et al. (2022) a cultura do mamoeiro possui grande importância econômica e social para a agricultura familiar, além de sua importância para o desenvolvimento regional. O Espírito Santo é um dos maiores exportadores de mamão, representando cerca de 49,3%, decorrente de sua produção tecnológica que garante qualidade e produtividade das lavouras, proporcionando atender a mercados internacionais mais exigentes (MAPA, 2021). 3.2 VÍRUS DA MELEIRA DO MAMOEIRO E MOSAICO 3.2.1 Vírus da meleira do mamoeiro no Brasil e sua dimensão pelo mundo A doença da meleira do mamoeiro é ocasionada pelo complexo viral papaya meleira virus (PMeV) e papaya meleira virus 2 (PMeV2) (Figura 2) (Antunes et al., 2016). A doença foi relatada pela primeira vez no Brasil na região nordeste em 1980 como ocasionada pela deficiência dos íons de cálcio e boro na planta decorrente de estresse abiótico (Nakagawa et al., 1987). PMeV possui dupla fita de RNA (dsRNA) com dois quadros de leitura aberta (ORFs), sendo a ORF1 responsável por decodificar proteínas estruturais (CP, do inglês, capside protein proteína capsidial) e a ORF2 decodificando uma RNA polimerase dependente de RNA (RdRp), semelhante aos vírus da ordem dos Ghabrivirales e que incluem a família Totiviridae (Antunes et al., 2020; Maurastoni et al., 2023). Maurastoni et al. (2023) verificaram que o PMeV possui a organização do seu genoma e de clivagem do N-terminal semelhantes vírus da família Fusagraviridae, o denominando de um fusagra-like. Enquanto PMeV2 é um vírus de fita simples de RNA (ssRNA) com ausência em seu genoma do gene de decodificação de proteínas estruturais responsáveis pela formação do capsídeo, sendo semelhante aos umbravírus. Assim, necessitando da presença de um vírus auxiliar para encapsidação do seu material genético (Taliansky; Robinson, 2003; Antunes et al., 2020). 19 Figura 2. Organização genômica dos vírus da meleira do mamoeiro. PMeV: ORF1 decodifica a proteína capsidial (CP) (1.563 aa) e ORF2 codifica a RNA polimerase dependente de RNA (RdRp) (1.147 aa); PMeV2: ORF1 codifica uma proteína hipotética (270 aa) e ORF2 codifica a RdRp (473 aa). Fonte: Almeida et al. (2024). Do ponto de vista sintomatológico, a meleira do mamoeiro apresenta a exsudação do látex de forma fluida ocasionando necrose em frutos, comprometendo a sua qualidade, a queima da ponta de folhas jovens e manchas sazonais (Figura 3) (Antunes et al., 2020). Figura 3. Sintomatologia da meleira do mamoeiro em plantas no campo. A) Pontas de folhas jovens queimadas; B) Exsudação livre e espontânea do látex e manchas necróticas em frutos de mamão resultado da oxidação do látex em contato com ar; C, D e E) Látex fluído. Fonte: Almeida, 2024. Além do Brasil, o vírus também se torna presente no México (Perez-Brito et al., 2012), Equador (Quito-Avila et al., 2015) e Austrália (Pathania et al., 2019). Fazendo 20 com que o vírus da meleira seja considerado como emergente em novas áreas, gerando preocupações aos produtores do fruto ao redor do mundo (Antunes et al., 2020). O Equador registrou a presença do complexo viral associado ao mamoeiro, composto pelo complexo papaya stick fruit-associated virus (PSFaV) e papaya virus Q (PpVQ) (Figura 4) (Quito-Avila et al., 2023; Almeida et al., 2024). Figura 4. Organização genômica do vírus PSFaV com duas ORFs em sua estrutura, a ORF1 entre os nucleotídeos 743 e 5518, responsável pela codificação das proteínas estruturais da proteína capsidial (CP) e a ORF2 entre os nucleotídeos 5800 e 9163, responsável pela codificação das proteínas estruturais da proteína capsidial (CP) e a ORF2 entre os nucleotídeos 5800 e 9163, responsável pela codificação de uma RNA polimerase dependente de RNA (RdRp). PpVQ possui duas ORFs em sua estrutura, a ORF1 entre os nucleotídeos 9 e 995, responsável pela codificação de uma proteína putativa e a ORF2 entre os nucleotídeos 995 e 2575, responsável pela codificação de uma RNA polimerase dependente de RNA (RdRp). Fonte: Almeida et al. (2024) A sistematização do vírus no Equador se iniciou em 2015 quando foi identificado um genoma parcial de um vírus de RNA em plantas de C. papaya. A análise do fragmento sequenciado revelou uma proteína putativa RNA polimerase dependente de RNA (RdRp), apresentando cerca de 40% de homologia de aminoácidos com a região RdRp de vírus pertencentes ao gênero Umbravirus. Com base nessa similaridade, o agente foi denominado papaya virus Q (PpVQ), classificado como um vírus de RNA de fita simples de sentido positivo ((+)ssRNA) (Quito-Avila et al., 2015). Na Austrália a doença foi identificada pela primeira vez em Queensland no ano de 2014, onde afetou mamoeiros, causando mudanças estéticas aos frutos e alterações sensoriais (Campbell, 2018). De maneira geral, o quadro sintomatológico é semelhante em todos os países onde a doença foi relatada, resultando na 21 inviabilidade comercial dos frutos para exportação e impactando significativamente o mercado internacional do mamão. 3.2.2 Vírus do mosaico A doença do mosaico ou da mancha anelar ocorre na presença do Papaya ringspot virus P (PRSV-P), gênero Potyvirus, família Potyviridae e genoma constituído por uma fita simples de RNA senso positivo ((+) ssRNA). O PRSV é transmitido por afídeos a partir de proteínas produzidas pelo gene (HC-Pro) e inoculação mecânica (Gonsalves et al., 2010). Tanto o PMeV, PMeV2 e PRSV já foram relatados concomitantemente em plantações de C. papaya demonstrando sintomas mútuos. Desse modo, o PRSV- P provoca distorção de folhas jovens e o desenvolvimento de frutos economicamente inviáveis (Figura 5 a e b) (Gonsalves et al., 2010). Figura 5. Sintomas característicos do vírus da mancha anelar do mamoeiro (PRSV-P). (a) Folha apresentando severa distorção e mosaico devido à infecção viral; (b) Fruto exibindo manchas anelares típicas causadas pelo vírus. Fonte: Eiras; Chaves, (2017). De acordo com os aspectos fitossanitários envolvendo a cultura do mamoeiro, as doenças viróticas da meleira do mamoeiro e mosaico ocasionam perdas de lavouras inteiras através de práticas como o rouguing. Deste modo, torna-se necessário a identificação da doença no campo de forma precoce em plantas doentes com sintomas iniciais, do contrário, a permanência de plantas doentes em lavouras pode servir como fonte de inóculo viral (Galeano et al., 2022). Outros vírus também ocasionam implicações econômicas na cultura do 22 mamoeiro, tais quais Papaya mosaic virus (PapMV), Papaya mild yellow leaf virus (PMYLV), Papaya leaf curl virus (PaLCuv), Papaya leaf crumple virus (PaLCrV), entre outros. 3.3 RELAÇÃO VÍRUS-PLANTA NA VIA FOTOSSINTÉTICA A fotossíntese, processo primordial de sobrevivência e produtividade das plantas, utiliza a energia luminosa para a excitação de elétrons das moléculas dos pigmentos clorofila e carotenóides que, quando transferidos para a cadeia de transporte de elétrons (CTE), são usados na etapa fotoquímica. Uma pequena parte da energia de excitação não é utilizada na etapa fotoquímica, sendo dissipada como calor ou emitida como fluorescência. Em 1931, Kautsky e Hirsh descobriram que o tecido fotossintético, após uma adaptação ao escuro seguido de um flash de luz saturante, apresenta modificações nas características de emissão da fluorescência. O conhecido efeito Kautsky é a base da técnica da fluorescência transiente da clorofila a usada para avaliar as propriedades fotossintéticas funcionais de uma planta. Estudos com a fluorescência da clorofila a podem indicar a influência externa inibindo ou estimulando o desenvolvimento da planta (KAUTSKY e HIRSCH, 1931; STIRBET et al., 2014; STRASSER e STRASSER, 1995; STRASSER et al., 2000; STRASSER et al., 2010). Ao receber a energia luminosa as moléculas de clorofila deixam seu estado basal indo para o estado excitado denominado estado singleto 1. Após receberem a energia dos fótons os pigmentos fotossintéticos dissipam esta energia por meio de três vias de dissipação que são: dissipação fotoquímica, fluorescência e calor (CAMPOSTRINI, 2008; BAKER; ROSENPVIST, 2004). A análise das diversas variáveis da fluorescência da clorofila a determina a eficiência fotoquímica da fotossíntese, sendo suas principais variáveis calculadas a partir da fluorescência inicial - F0), fluorescência máxima (indica a completa redução da Quinona A (QA) indicando que todos os centros - Fm), fluorescência variável (representa o fluxo de elétrons do centro de reação do fotossistema II (P680) até a plastoquinona FV) e rendimento quântico máximo do fotossistema II (rendimento quântico dos processos fotoquímicos desse fotossistema FV/FM) (OUKARROUM et al., 2009; MAXWELL; JOHNSON, 2000). O parâmetro que informa o desempenho das 23 reações iniciais de oxido-redução do fotossistema II é o PIabs e o desempenho total para a conservação de energia de fotóns absorvidos por toda a cadeia de transporte de elétrons é o PItotal sendo, portanto, um indicativo da intensidade de fotossíntese (CHEN et al. (2017). Os açúcares produzidos durante a etapa bioquímica da fotossíntese são responsáveis pelo sabor, aroma e textura dos frutos, desejável em seu último estágio de maturação (Oliveira et al., 2006). Plantas sob a estresses bióticos, como na presença de vírus, podem possuir suas taxas de fotossíntese alteradas e podem favorecer ao acúmulo viral (Soares et al., 2017; Antunes et al., 2020). Em situações de estresse, ocorre um aumento na produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) ocasionando danos a macromoléculas essenciais de DNA e proteínas (Gururani et al., 2015). Fatores bióticos, como a presença de vírus, implicam na redução do teor de Chl a (Jadão et al., 2004). Isolados virais de Lettuce mosaic virus (LMV) e Lettuce mottle virus (LeMoV) em plantas de alface (Lactuca sativa) são capazes de reduzir a absorção de luz pelas folhas da planta ocasionando diferenciação entre áreas foliares (Jadão et al., 2004) decorrente da deterioração de moléculas de clorofila nos locais que se desenvolvem os sintomas (Leite; Pascholati, 1995). Além de ROS, o estresse biótico pode originar compostos intermediários reativos de oxigênio (ROIs) (Jones et al., 2006; Madroñero et al., 2018). Os ROIs são abundantemente produzidos nos cloroplastos, sendo produtos originados durante a etapa fotoquímica decorrente de limitações na fixação de CO2. Isto desencadeia um retrocesso na cadeia transportadora de elétrons e uma elevada relação entre NADPH/NADP no FSI provocando a transferência de elétrons para o oxigênio molecular que resulta na formação de radicais superóxidos (Miller et al., 2010). Essa interação entre planta-patógeno resulta em deficiências do desenvolvimento vegetativo e interferência direta na qualidade dos frutos, devido a ativação de vias do proteassoma responsáveis por desencadear uma resposta hipersensível para degradação das partículas virais. As alterações no metabolismo da planta decorrentes da infecção podem resultar em paralisação do seu crescimento e modulação da taxa fotossintética. Além do mais, a severidade da infecção pode estar atrelada a aspectos de interação entre patógeno, hospedeiro, vetor e meio ambiente (Provvidenti, 1996). 24 3.3.1 Fotossíntese no mamoeiro em condições de estresse A introdução da cultura do mamoeiro em diversas regiões do Brasil leva em consideração as necessidades de adaptações de diversos cultivares a partir de suas pré-disposições geográficas e ambientais. Isto se torna relevante, visto que podem interferir diretamente no desenvolvimento de diferentes genótipos de mamoeiros afetando seu metabolismo fotossintético. Esse conhecimento permite otimizar expectativas de produtividade diante da disponibilidade de água e nutrientes do local de plantio (Peçanha, 2010). Em condições de exposição ao estresse biótico e abiótico, plantas sensíveis, como Carica papaya estão sujeitas a variações em suas taxas fotossintéticas e, consequentemente no crescimento e desenvolvimento. Em processos infecciosos, como os provenientes do complexo viral papaya meleira virus, as células de C. papaya sofrem inchaço e consequente ruptura que estão associados estrategicamente a movimentação viral (Rodrigues et al., 2009). A infecção compromete as células através de microlesões que favorecem o rompimento da parede celular como ponto de contato entre o vírus-célula (Seisenberger et al., 2001) podendo comprometer o processo da fotossíntese. O estresse ocasionado também desencadeia a constituição de diversos compostos moleculares (taninos, terpenos, entre outros) relacionados aos mecanismos de defesa da planta relacionado a sua defesa e proteção (Soares; Machado, 2007). A implementação da metodologia de avaliação da fluorescência da clorofila a pode fornecer subsídios para identificar diferentes alterações provocadas pelo estresse possibilitando sua diagnose e uma rápida avaliação das condições da planta (Tóth, 2006). A alta sensibilidade dos fotossistemas (FSI e FSII), RC e dos complexos proteína-pigmentos podem ser bons indicadores da presença do vírus tornando essa metodologia facilmente aplicável (Gonçalves et al., 2010; Thoren et al., 2010). 25 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1. Área experimental e material vegetal O estudo foi conduzido utilizando plantas de mamoeiro (Carica papaya L.), cultivar Aliança, sendo as avaliações realizadas em dois municípios do estado do Espírito Santo, ao longo de três períodos distintos do desenvolvimento da cultura. A primeira etapa de coleta foi realizada em outubro de 2022, no distrito de Rio Quartel, município de Linhares, ES S; O / 19,522716; 40,216967). Nessa ocasião, as plantas encontravam-se em fase de frutificação, com aproximadamente 24 meses após o plantio, apresentando sintomas severos característicos do mosaico do mamoeiro e da doença da meleira. Após a realização das medições fisiológicas e da coleta das amostras foliares, as plantas foram eliminadas conforme preconiza a Instrução Normativa nº 17 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), de 27 de maio de 2010. Foram avaliadas dez plantas por tratamento. A segunda e a terceira coletas foram realizadas no município de Guaraná, Aracruz, ES S; O / 19,639578; 40,251265). As amostragens ocorreram nos meses de dezembro de 2022 e maio de 2023, contemplando plantas visualmente assintomáticas (A) e plantas sintomáticas (S). Na segunda coleta, as plantas apresentavam oito meses de idade e estavam no início do primeiro ciclo de frutificação. Já na terceira coleta, as avaliações foram realizadas em plantas com aproximadamente 13 meses após o plantio. Os tratamentos foram definidos da seguinte forma: A/DEZ folhas assintomáticas de plantas com oito meses após o plantio, coletadas em dezembro de 2022; A/MAI folhas assintomáticas de plantas com 13 meses após o plantio, coletadas em maio de 2023; S/DEZ folhas sintomáticas de plantas com oito meses após o plantio, coletadas em dezembro de 2022; S/MAI folhas sintomáticas de plantas com 13 meses após o plantio, coletadas em maio de 2023; e SG/OUT folhas com sintomas graves de infecção viral provenientes de plantas com 24 meses após o plantio, coletadas em outubro de 2022. Adicionalmente, amostras de folhas de plantas consideradas saudáveis foram coletadas em áreas de cultivo submetidas a monitoramento diário, com o objetivo de identificar precocemente o surgimento de sintomas de infecção viral. 26 4.2. Fluorescência transitória da clorofila a A fluorescência transitória da clorofila a foi avaliada com o auxílio de um Unido). As medições foram realizadas em folhas completamente expandidas, durante o período da manhã, visando minimizar possíveis efeitos da elevada temperatura e da alta intensidade luminosa sobre os processos fotossintéticos. Em cada experimento foram avaliadas dez plantas, sendo realizadas cinco leituras por folha. Antes das medições, as folhas foram submetidas à aclimatação ao escuro por um período de 40 minutos, tempo necessário para garantir a completa oxidação dos centros de reação dos fotossistemas. Após esse período, as folhas foram expostas a um pulso de luz vermelha saturante, com intensidade de 3000 m ² s ¹. As intensidades de fluorescência foram registradas no intervalo temporal entre ) e aproximadamente 300 ms à fluorescência máxima (F ). Os dados obtidos foram normalizados para fluorescência variável relativa (Vt), calculada pela equação Vt = (Ft F )/(F F ). As diferenças entre os tratamentos foram determinadas tomando-se como referência as plantas do grupo A/DEZ, obtendo-se os valores de = F(tratamento) F(referência). A partir das intensidades de fluorescência, os parâmetros fotoquímicos foram calculados utilizando o teste JIP, conforme descrito em Strasser et al., 2010. 4.3. Índice de clorofila O índice total de clorofila foi determinado nas mesmas folhas utilizadas para as medições de fluorescência da clorofila a, por meio de um medidor portátil SPAD-502 Plus (Konica Minolta Optics Inc., Osaka, Japão). O equipamento estima o conteúdo relativo de clorofila a partir da medição da absorbância óptica em dois comprimentos de onda distintos, 620 e 940 nm, constituindo um método rápido, não destrutivo e de baixo custo para a avaliação do estado nutricional e fisiológico das plantas. 4.4. Diagnóstico molecular As amostras foliares provenientes das mesmas dez plantas utilizadas nas 27 análises de fluorescência da clorofila a e no índice de clorofila também foram empregadas para a detecção molecular dos vírus associados aos sintomas de mosaico e da doença da meleira. As análises seguiram metodologias previamente estabelecidas e descritas em estudos anteriores. Para a realização das análises moleculares, o tecido foliar de cada planta foi coletado e agrupado, assegurando quantidade suficiente de material e maior reprodutibilidade no processo de extração. O RNA total foi extraído utilizando o reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), de acordo com as recomendações do fabricante. A amplificação dos fragmentos virais foi realizada por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR), empregando-se a enzima Taq DNA Polimerase (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), conforme os protocolos padronizados. Além disso, folhas de plantas assintomáticas provenientes das áreas de cultivo monitoradas diariamente foram coletadas com o intuito de possibilitar a detecção precoce de infecções virais antes do aparecimento de sintomas visuais. 4.5. Delineamento experimental e análise estatística O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado, considerando dois grupos de tratamento: plantas assintomáticas e plantas sintomáticas, avaliadas em três estágios de desenvolvimento da cultura, correspondentes a oito meses (dezembro de 2022), 13 meses (maio de 2023) e 24 meses após o plantio (outubro de 2022). Cada planta foi considerada uma unidade experimental independente. Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância (ANOVA) para verificar os efeitos dos tratamentos. Quando observadas diferenças significativas pelo teste F, as médias foram comparadas pelo teste de Tukey (HSD), adotando-se nível o software INFOSTAT, versão 2020 (Grupo Infostat, Córdoba, Argentina). 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 28 Studies on the Differentiation of Transient Chlorophyll a Fluorescence Signals in Papaya Plants Showing Symptoms and Without Symptoms in the Presence of PRSV-P and PMeV Viruses Weverton Pereira de Medeiros 1 , Oeber de Freitas Quadros 2 , Sabrina Garcia Broetto 1 , José Aires Ventura 2,3 and Diolina Moura Silva 1,* 1 Nucleo de Estudos da Fotossintese, Universidade Federal do Espirito Santo, Vitoria 29075-010, ES, Brazil;wevertonmedeiros74@gmail.com (W.P.d.M.); sabroetto@yahoo.com.br (S.G.B.) 2 Nucleo de Biotecnologia, Universidade Federal do Espirito Santo, Vitoria 29040-090, ES, Brazil; oeberquadros@gmail.com (O.d.F.Q.); jose.a.ventura@ufes.br (J.A.V.) 3 Instituto Capixaba de Pesquisa, Assistencia Tecnica e Extensao Rural, Vitoria 29052-010, ES, Brazil * Correspondence: diolina.silva@ufes.br Academic Editor: Sergey Morozov Received: 11 September 2025 Revised: 13 October 2025 Accepted: 15 October 2025 Published: 19 October 2025 Citation: de Medeiros, W.P.; Quadros, O.d.F.; Broetto, S.G.; Ventura, J.A.; Silva, D.M. Studies on the Differentiation of Transient Chlorophyll a Fluorescence Signals in Papaya Plants Showing Symptoms and Without Symptoms in the Abstract Viral infections represent a critical threat to cultivated plant species. In papaya cultivation, two viral diseases papaya mosaic (caused by papaya ringspot virus type P PRSV-P) and papaya sticky disease (caused by a virus complex of papaya meleira virus PMeV, and papaya meleira virus PMeV2) are prevalent and capable of devastating entire planta- tions, incurring substantial economic losses. Current diagnostic practices rely on visual identification of symptoms and elimination of infected plants (roguing). Monitoring photo- synthetic efficiency in orchards prone to PRSV-P and PMeV2 coinfection may allow early intervention, mitigating productivity losses and reducing fruit quality. This study aimed to evaluate chlorophyll a fluorescence as a biomarker for photosynthetic impairment and symptom severity in papaya infected with PRSV-P and/or PMeV2 and to explore the feasi- bility of early detection of the infection by these dual pathogens, as an exploratory study under field conditions. Chlorophyll a fluorescence revealed details about the physiology of plants coinfected with the complex of PMeV2 and PRSV-P: the electron motive force within PSII decreases in infected plants and in those without visual symptoms of infection, being proportional to the age and developmental stage of the plants. A slowdown in the multiple electron transfer turnover of PSII and a decrease in the efficiency of the redox reactions of photosystem I were observed in plants with or without visual detection of infection. The evidence generated suggests that the chlorophyll a fluorescence technique can be used to monitor the pathophysiological state of plants under biotic stress. Keywords: papaya ringspot virus; sticky disease; chlorophyll a fluorescence; co-infection; non-destructive analysis Presence of PRSV-P and PMeV Viruses. Plants 2025, 14, 3208. https://doi.org/10.3390/plants14203208 Copyright: © 2025 by the authors. Licensee MDPI, Basel, Switzerland. This article is an open access article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution (CC BY) license (https://creativecommons.org/ licenses/by/4.0/). 1. Introduction The papaya (Carica papaya L.) is an economically important tropical fruit crop cul- tivated worldwide, with Brazil, India, Mexico, and the Dominican Republic among the leading producers. In Brazil, papaya production is concentrated in the state of Espírito Santo, where the crop plays a significant role in the agro-industrial economy. However, viral diseases pose a major threat to papaya cultivation, often leading to severe yield losses and reduced fruit quality [1]. Plants 2025, 14, 3208 https://doi.org/10.3390/plants14203208 29 Plants 2025, 14, 3208 Three types of viruses, which cause mosaic and sticky disease, are particularly destruc- tive: papaya ringspot virus type P (PRSV-P), responsible for mosaic disease, and the papaya meleira virus complex (PMeV + PMeV2), which causes sticky disease. Both can infect plants at different developmental stages and spread rapidly under field conditions, sometimes re- maining asymptomatic until flowering. Current control relies almost exclusively on visual detection and roguing a method that is fast and low-cost but limited in sensitivity and often ineffective against asymptomatic infections. These limitations highlight the need for more sensitive, early, and non-destructive diagnostic approaches [2 4]. Visual symptoms of meleira, for example, typically become evident only after flowering, following a prolonged asymptomatic period, and early signs are often indistinguishable from other conditions, highlighting the need for alternative diagnostic approaches [5]. Papaya ringspot virus (PRSV-P) can infect plants at any stage of growth in a systematic manner. This virus, transmitted mainly by aphids [6], harbors an approximately 10.3 kb positive-sense, single-stranded RNA (ssRNA) genome containing a single open reading frame (ORF). This ORF encodes a large polyprotein that is processed into smaller proteins with diverse functions [7]. Papaya sticky disease is caused by a viral complex (PMeV) composed of a fusagravirus, also known as papaya meleira virus (PMeV), and the umbravirus-associated RNA (ulaRNA) virus papaya meleira virus 2 (PMeV2), which infects papaya plants in Brazil [8,9]. The PMeV viral complex usually infects the plant 6 to 8 months after seed germination, and the plant remains asymptomatic until flowering [5]. PMeV has a double-stranded RNA (dsRNA) genome of approximately 10 kb [10] or 12 kb. PMeV forms isometric, spherical particles approximately 38 42 nm in diameter, lacking external projections [11], containing two ORFs that encode a capsid protein (CP) and an RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) [4]. PMeV2 is an ssRNA virus that lacks its own capsid and depends on the PMeV CP for encapsidation [4]. PMeV can even be detected in asymptomatic plants, and both viral RNAs can be detected in all symptomatic plants. In contrast, papaya ringspot virus type P (PRSV-P), which causes mosaic, is characterized by non-enveloped, flexuous, filamentous particles measuring about 760 800 nm in length and 12 nm in diameter, as reported by [12] and further confirmed by recent studies [13]. These structural differences reflect divergence and have implications for their detection and transmission. Plant viral infections progress through a sequence of events that begin with pathogen entry and replication, followed by systemic movement and interaction with host cellular processes. These interactions can alter plant physiology and metabolism before visible symptoms appear. Symptoms, such as chlorosis, mosaic, sticky latex, necrosis, or growth reduction, represent the external manifestation of the disease, but their presence depends on the virus, host genotype, and environmental conditions [14]. Understanding the tem- poral development of viral infection and symptom expression is essential for interpreting physiological indicators of stress, such as changes in chlorophyll a fluorescence. There is extensive literature on viral infections in various plant species. Sugarcane yellow leaf virus (ScYLV) infection in sugarcane (Saccharum spp.) causes severe foliar symp- toms and major changes in photosynthesis and metabolism [15]. Silencing the cytoplasmic receptor-like kinase gene TaRKL1 reduces photosynthetic capacity in wheat, showing its role in photosynthesis and H2O2 homeostasis [16]. Deg proteases are also essential for pho- toprotection and PSII repair in cereals [17]. In pepper (Capsicum annuum), the begomovirus chili leaf curl disease (ChiLCD) significantly impairs fruit and seed production [18]. Viral infestations, therefore, lead to major losses in many crops by disrupting metabolism and reducing plant vigor and reproduction. Viral infections follow a series of steps entry, replication, and systemic spread that disturb host metabolism and physiology, often before symptoms appear. The disease refers 30 Plants 2025, 14, 3208 to the physiological disorder, while symptoms like chlorosis, necrosis, or growth reduction depend on the virus, host genotype, and environment [14,19]. Early physiological changes, including photosynthetic alterations, offer key insights into plant virus interactions and can be monitored non-invasively using chlorophyll a fluorescence [20,21]. In the papaya tree, previous studies have shown that during plant development under stress, changes in primary metabolism and photosynthesis occur [22 25]. In fact, PRSV-P causes severe chlorosis symptoms in the leaves of C. papaya plants. Ref. [26] used the rapid kinetics of Chl a fluorescence induction in healthy and PRSV-P-infected plants, and the results revealed damage to the electron transfer equilibrium on the acceptor side of PSII between QA and QB and to the size of the intersystem electron acceptor pool. Ref. [27] performed a virome network analysis in papaya orchards from two agroecological regions of Chiapas, Mexico; their findings suggested that management strategies need to be customized for each region and that visual assessment of papaya may be insufficient for PRSV, requiring diagnostic assays. They also warned that disease management strategies may not be successful if they are based solely on visual assessments and diagnostic assays for known individual viruses, as they found virus virus interactions that could modify host symptoms. After infecting plants, viral complexes alter physiological and biochemical processes, in addition to causing other tissue modifications, which can be visually detected in crops [28]. The infection compromises, for example, the functionality and morphology of chloroplasts, consequently altering the concentration of chlorophyll, which in turn affects plant growth and productivity [29,30]. Previous studies have shown that PRSV infections, whether single or mixed, are common in papaya and can produce multiple symptom patterns in the host [31]. Simultaneous viral infections have been previously reported [32 35]. The period of infection and the order in which viruses, in mixed infections, inoculate host tissues also significantly affect their interactions and can result in a range of responses [36]. Early detection of the disease will be highly valuable, considering that the average life expectancy of a papaya plant is 24 months and that from the tenth month, the plant begins to produce fruit continuously until the end of the cycle. Detection of the virus, either in the initial phase of vegetative growth or at the beginning of reproductive growth, would help producers avoid unnecessary investment in the crop. Currently, producers use visual diagnosis to detect the infections caused by the viruses (PMeV and PRSV-P), as this is a fast and economical method. This method, however, has technical limitations. Papaya growers train field workers to visually identify plants with mosaic and/or sticky disease symptoms in papaya plantations and, upon detection, perform roguing. According to [9], without the implementation of this agricultural practice, these diseases would spread throughout the crop, resulting in total production losses. Although roguing has proven to be an effective strategy for controlling papaya viruses, its success depends on intensive monitoring. Even if are adequately trained to identify disease symptoms early, other measures need to be implemented, such as vector control, crop rotation, and the adoption of phytosanitary technology protocols that ensure the absence of quarantine pests in papaya-importing countries. Thus, viral diseases in papaya are becoming increasingly complex, and for decades, papaya growers have faced the challenge of preventing and controlling infections caused by PRSV-P and the PMeV viral complex. Accurate and early molecular diagnosis [37,38] greatly facilitates the rapid and effective identification of these pathogens, allowing the development of more efficient management measures and control strategies aimed at mitigating the economic and agronomic impacts of these diseases on papaya crops. However, the method is invasive and has limited applicability. Proximal sensing methods, such as chlorophyll a fluorescence, 31 Plants 2025, 14, 3208 make use of the possibility of evaluating physiological changes before changes in leaf structure occur, exhibiting greater sensitivity than that of other methods [39,40]. Monitoring the photosynthetic efficiency of C. papaya during different stages of de- velopment in orchards where both diseases can occur systematically will help in the early prevention of the disease, preventing farming losses caused by the severity of symptoms in infected green tissues and the associated reduction in crop productivity and in the economic value of the fruit. This study aimed to (a) use chlorophyll a fluorescence as a tool to evaluate the loss of photosynthetic efficiency and the severity of symptoms in green tissues infected by the mosaic virus and/or the papaya sticky disease virus and (b) explore the possibility of performing detection of the physiological alterations induced by both viral diseases in papaya plantations. 2. Results The polyphasic chlorophyll a fluorescence transient (OJIP curve) revealed clear alter- ations in the photosynthetic performance of Carica papaya plants infected with papaya ringspot virus (PRSV-P) and/or papaya meleira virus complex (PMeV + PMeV2) at differ- ent developmental stages (Figure 1a). After double normalization of the fluorescence data (Figure 1b), differences in the relative variable fluorescence ( Vt) became evident between asymptomatic and symptomatic plants (Figure 1c). Negative differences appeared in the J I phase in symptomatic plants at 13 months (S/MAY), while positive differences occurred in the O J and J I phases in symptomatic plants at 8 months (S/DEC) and in severely symptomatic plants at 24 months (SG/OCT). Although a slight decrease in maximum fluorescence (P-step, ~300 ms) was observed in infected plants, the normalization of the fluorescence transients allows a clearer comparison of kinetic differences among treatments. In severely symptomatic plants (SG/OCT), pronounced positive L- and K-bands were detected (Figure 2), indicating impaired connectivity among PSII units and a disturbance in the oxygen-evolving complex (OEC). These changes indicate stress response but require complementary analyses for mech- anistic confirmation. Similar L- and K-band signatures were also observed, though with lower amplitude, in asymptomatic and symptomatic plants sampled at 13 months. The presence of these bands suggests structural and functional stress in PSII even in the absence of visible disease symptoms. Analysis of JIP-test parameters showed significant differences among treatments (Figure 3). Younger plants (A/DEC) exhibited the highest total performance index (PITOTAL), total driving force (DFTOTAL), and energy flux to the PSI acceptor side (RE0/CS0). In contrast, PITOTAL declined progressively from asymptomatic (A/MAY) to symptomatic (S/MAY and S/DEC) plants, reaching the lowest values in severely symp- tomatic plants (SG/OCT). The maximum PSII performance index (PIABS) decreased grad- ually with disease progression, while energy dissipation per reaction center (DI0/RC) increased with plant age and symptom severity. The analysis of the maximum quantum yield of PSII photochemistry ( P0 FV/FM) revealed a progressive decline relative to asymptomatic reference plants (A/DEC = 1.0). In symptomatic plants sampled at 8 months (S/DEC), P0 decreased by 2.18%, while asymptomatic plants at 13 months (A/MAY) showed a 4.54% reduction. Symptomatic plants at the same stage (S/MAY) exhibited a 5.47% decrease, and the lowest value was observed in severely symptomatic plants at 24 months (SG/OCT), with an 8.91% reduction compared to the control (For further details, see Supplementary Table S2). These results 32 Plants 2025, 14, 3208 demonstrate a gradual loss of maximum PSII potential associated with disease progression and symptom severity. Figure 1. Polyphasic chlorophyll a fluorescence induction curves (OJIP). Fluorescence induction time is shown on a logarithmic scale. (a), relative variable fluorescence (Vt) after double normalization (b), and difference curves ( Vt) (c) of papaya cv. Aliança leaves at different developmental stages and infection conditions. A/DEC: asymptomatic leaves, 8 months; S/DEC: symptomatic leaves, 8 months; A/MAY: asymptomatic leaves, 13 months; S/MAY: symptomatic leaves, 13 months; SG/OCT: severely symptomatic leaves, 24 months. Vt represents relative variable fluorescence normalized between minimum (F0) and maximum fluorescence (FM). Vt indicates the difference in Vt compared with the A/DEC reference. Time is shown on a logarithmic scale (ms). r.u., relative units. (n = 10). 33 Plants 2025, 14, 3208 Figure 2. Differential curves ( Vt) of chlorophyll a fluorescence transients in papaya cv. Aliança leaves under different infection conditions: A/DEC = Ref (asymptomatic, 8 months), A/MAY (asymp- tomatic, ~13 months), S/DEC (symptomatic, 8 months), S/MAY (symptomatic, ~13 months), and SG/OCT (severely symptomatic, 24 months). Asymptomatic plants (A/DEC) were used as the reference ( Vt = 0). (a) K-band (~300 µs) indicates oxygen-evolving complex (OEC) destabilization; (b) L-band (~150 µs) reflects impaired connectivity among PSII units; (c) H-band (~20 ms) shows slowed electron transfer from PSII to the plastoquinone pool; and (d) G-band (~100 ms) indicates reduced efficiency of electron transfer to PSI acceptors. Positive bands reveal progressive photosyn- thetic impairment associated with viral infection, even before visible symptoms. Time is plotted on a logarithmic scale (µs ms), and Vt is expressed in relative units (r.u.) (n = 10). Figure 3. Radar plot of selected JIP-test parameters derived from chlorophyll a fluorescence measure- ments of papaya cv. Aliança leaves under different infection conditions: A/DEC (asymptomatic, 34 Plants 2025, 14, 3208 8 months), A/MAY (asymptomatic, ~13 months), S/DEC (symptomatic, 8 months), S/MAY (symp- tomatic, ~13 months), and SG/OCT (severely symptomatic, 24 months). Values are normalized to the asymptomatic reference (A/DEC = Ref = 1.0). (n = 10). Abbreviations: P0 (=Fv/FM), maximum quantum efficiency of PSII in dark-adapted leaves; E0, probability that an absorbed photon moves an electron beyond QA; E0, quantum yield of electron transport; R0, relative electron flux per reaction center; R0, efficiency of reduction in the final PSI acceptor; PIABS, performance index on absorption basis; DFABS, (density of absorbed photons per unit leaf area); PITOTAL, total performance index; ABS/CS0, absorbed energy flux per cross section; DI0/CS0, dissipated energy flux per cross section; TR0/CS0, trapped energy flux per cross section; ET0/CS0, electron transport flux per cross section; RE0/CS0, electron flux reducing the end acceptors at the PSI acceptor side per cross section; DFTOTAL, total photon flux density incident on the leaf surface (total number of photons reaching the leaf per unit area. Statistical analyses of the raw data are provided in Supplementary Table S2. No significant differences in total chlorophyll content (SPAD index) were detected between asymptomatic and symptomatic plants at 8 or 13 months. However, plants showing severe symptoms at 24 months exhibited significantly reduced chlorophyll levels (Table 1), consistent with advanced physiological decline. Table 1. Total chlorophyll content (SPAD index) of papaya cv. Aliança with severely symptomatic (SG), asymptomatic (A) and symptomatic (S) leaves and fruits, measured in October 2022, December 2022 and May 2023 on rural properties in the rural area of Aracruz and Linhares, ES. Mean ± SE, (n = 10). SG/OCT A/DEC S/DEC A/MAY S/MAY Chla 39.8 ± 4.76 52.55 ± 5.10 48.2 ± 4.52 49.55 ± 2.50 48.2 ± 1.61 The S/DEC samples presented varying patterns of PMeV2 and PRSV-P gene presence (Figure 4). The analyzed samples presented either both viruses (samples S-1 and S-2) or only PRSV-P (samples S3 and S4). Figure 4. PCR amplification products for detection of papaya meleira virus (PMeV2; 814 pb) and papaya ringspot virus (PRSV-P; 228 pb) in papaya samples. (M) 1 Kb Plus DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) and a control sample (C+) containing both PMeV2 and PRSV-P viruses. (n = 10). Agarose gel electrophoresis (1%) showed two distinct profile patterns for the plants. Samples S1 and S2 presented two well-defined bands consistent with the sizes of the PMeV2 (814 bp) and PRSV-P (228 bp) amplicons, indicating coinfection, whereas the symptomatic plant samples S3 and S4 showed a single, well-defined band at the position corresponding to ~200 bp, compatible with the expected size for the PRSV-P (amplified with specific 35 Plants 2025, 14, 3208 primers). There were no additional bands, indicating the absence of coinfection. The positive control confirmed the specificity of the reaction. In plants showing co-infection, the physiological alterations were more pronounced, including higher positive L- and K-band amplitudes, lower PITOTAL, and reduced RE0/CS0 values. These plants also exhibited increased DI0/RC compared with plants infected by a single virus, indicating a stronger disruption of PSII photochemistry and electron transport. PRSV-P was detected even in asymptomatic plants sampled at 13 months (A/MAY) (Figure 5). Although these plants showed no visible disease symptoms, their fluorescence parameters differed from those of younger asymptomatic plants (A/DEC), including slightly elevated RE0/CS0 and R0 values and the presence of a weak positive L-band. These results indicate that viral infection was already affecting photosynthetic performance before symptom expression. Figure 5. PCR detection of papaya meleira virus (PMeV2; 814 pb) and papaya ringspot virus (PRSV-P; 228 pb) in asymptomatic papaya plants. (M) 1 Kb Plus DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific). Negative control (C ) shows no amplification. Positive control (C+) contains both viral targets. (n = 10). Symptomatic plants sampled in May (S/MAY) showed the presence of PMeV2 as the predominant viral component (Figure 6). These plants presented higher PITOTAL values than severely symptomatic plants (SG/OCT) but lower than those of asymptomatic plants (A/DEC), indicating intermediate physiological performance during infection progression. Molecular analysis of samples used in the fluorescence measurements confirmed the presence of both viral pathogens in symptomatic plants (Figure 7). Figure 6. PCR detection of papaya meleira virus (PMeV2; 814 pb) and papaya ringspot virus (PRSV-P; 228 pb) in symptomatic papaya plants. (M) 1 Kb Plus DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific). Negative control (C ) shows no amplification. (n = 10). 36 Plants 2025, 14, 3208 Figure 7. PCR detection of papaya meleira virus 2 (PMeV2; 814 pb) and papaya ringspot virus (PRSV- P; 228 pb) in symptomatic papaya plants. (M) 1 Kb Plus DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific). Positive control (C+). (n = 10). Co-infected plants showed the most severe deviations in fluorescence parameters, including lower PIABS, R0, and R0, and higher DI0/RC, compared with plants infected with a single virus. These results demonstrate that mixed infections are associated with more severe impairment of the photosynthetic apparatus. The detection of PRSV-P and PMeV by PCR confirms the presence of viral pathogens in the plants analyzed for chlorophyll a fluorescence, supporting the physiological changes observed in OJIP parameters. 3. Discussion In our experiment, we obtained specific Vt values that provided valuable information about the physiological state of uninfected plants (based on visual diagnosis) and those that already presented symptoms of the infection caused by the papaya ringspot virus (PRSV-P) and the papaya meleira virus (PMeV), allowing a comparison with plants that presented severe symptoms of infection (SG/OCT). Changes in the photosynthetic components that trigger and fine-tune the responses of infected plants to biotic stress have been reported by several authors. Viral infections can directly affect chloroplast function through interactions between viral proteins and compo- nents of the photosynthetic machinery, leading to the fluorescence alterations observed in this study. For example, silencing of the 33 kDa subunit of the oxygen-evolving complex (OEC) increases virus replication and compromises PSII activity [41], while TMV flavum reduces OEC protein levels and disrupts electron transport [42]. Interactions between viral proteins and PsbO also induce chloroplast structural changes [43], which may explain the increased K-band associated with OEC destabilization. Moreover, virus-induced reorgani- zation of thylakoid membranes and pigment protein complexes reduces excitation energy transfer efficiency [44], contributing to changes in the OJIP transient. Although abiotic stressors can produce similar patterns, future studies including abiotic controls are needed to validate the specificity of fluorescence-based viral detection. In 2017, Ref. [45] reported a relatively high content of photosynthesis-related proteins in PMeV-infected plants, confirming the involvement of the viral complex (PMeV) in photosynthesis. Ref. [25] quantified cellular proteins during the development of infected papaya plants and reported an increase in the efficiency of energy flow in the photosystems. We detected differences in the kinetics of chlorophyll a fluorescence emission and observed 37 Plants 2025, 14, 3208 that these differences occurred at the same points in the OJIP curve; however, depending on the development stage of the infected plants, the intensities were different. The observed increase in the K-band, particularly in highly infected plants (SG/OCT) and 13-month-old plants (A/S MAY), indicates early destabilization of the OEC. This pattern suggests that viral interference in photosystem II occurs before visible symptom manifestation, reflecting early stages of viral replication [46]. This statement was confirmed by the results we obtained when calculating the JIP test parameters [47,48]. There was little change in the energy flux in PSII (PIABS). Only the SG/OCT plants showed a sharp decrease. The captured energy flux (TR0/CS0) and the intersystem electron transport flux (ET0/CS0) did not differ between symptomatic and asymptomatic plants, except in severely symptomatic plants, where a sharp decrease was observed. The energy dissipation flux (DI0/CS0) gradually increased from younger to older plants. These results confirmed the presence of a positive K- band, which was higher in leaves with severe symptoms in October (SG/OCT) [49,50]. Consistently, the progressive decline in the maximum quantum yield of PSII photo- chemistry ( P0) across sampling points further supports this interpretation. This pattern reflects the progressive impairment of PSII reaction centers and the oxygen-evolving com- plex described under biotic stress conditions [51 53], and reinforces the utility of P0 (Fv/FM) as a sensitive indicator of functional changes in the photosynthetic apparatus during virus plant interactions. At the molecular level, viral proteins may directly interact with PSII components, including PsbO and D1, leading to structural destabilization and altered electron transport. Such interactions provide a mechanistic explanation for the early fluorescence changes observed even in asymptomatic plants, as previously reported for TMV [41,42] and Alter- nanthera mosaic virus [43], and are consistent with proteomic evidence of photosynthesis- related protein alterations in PMeV-infected papaya [25,45]. The presence of L-bands in asymptomatic (A), symptomatic (S) and severely symp- tomatic (SG) plants was consistently positive compared with that in the reference plants (A/DC). In all the treatments, the increase in each curve followed the same pattern as the K-band, with smaller curves for asymptomatic leaves of younger plants and larger curves for fully symptomatic leaves in October. Our results confirm the results of [25], who reported an accumulation of photosynthetic proteins followed by an accumulation of proteins involved in the synthesis of wall precursors. The authors suggest that C. papaya plants to maintain the integrity of the laticifer walls and fail to do so after 4 months, leading to latex exudation. The final stage of the electron transport chain, represented by the chlorophyll a fluo- rescence transient that reflects the efficiency of electron transfer from plastoquinol (PQH2) to PSI acceptors ( R0), was significantly influenced by both viral presence and plant age. Similar effects were reported in young maize plants under salt stress [49]. The higher values observed for the energy dissipation flux per cross section (DI0/CS0), the efficiency of electron transport from reduced plastocyanin to the PSI acceptor side ( R0), the quantum yield of electron transport from QA to the terminal PSI acceptors ( R0), the reduction flux through the cross section at t = 0 (RE0/CS0), and the total driving force based on the excited cross section (DFTOTAL) suggest that these parameters are more sensitive indicators of subtle differences than the multivariate performance indices (PIABS and PITOTAL). The H and G bands reflect later stages of photosynthetic impairment, with slowed electron transfer between PSII and PSI. Their presence in symptomatic plants indicates that viral effects progress gradually, allowing the association of fluorescence dynamics with intermediate and late stages of viral replication [54]. 38 Plants 2025, 14, 3208 Refs. [50,51] described the H- and G-bands as two distinct peaks between the I and P steps, corresponding to multiple turnover deceleration events within the electron transport chain: the second reduction of QB to QB 2 (H-band at 20 ms) and the formation of a second protonated quinone acceptor, PQH2 (G-band at 100 ms). In our results, the appearance of a positive H-band is particularly evident and likely reflects multiple turnovers slowing electron transfer from PSII to the PQ pool. This interpretation is supported by the concurrent decreases in PIABS and DFABS observed in May and SG plants. The formation of a positive G band indicates reduced efficiency of electron transfer to the acceptor side of PSI, suggesting impaired redox reactions possibly caused by viral infection (papaya meleira virus or papaya ringspot virus type P). Notably, a negative G-band was observed only in leaves of 8-month- old plants. It should be noted that measurements of OJIP-curves provide indirect information on photosystem II performance and plant physiological status. While valuable for rapid screening of stress responses, OJIP-based parameters alone are insufficient for unambigu- ous conclusions regarding the molecular mechanisms of viral infection. Therefore, results should ideally be complemented with biochemical or biophysical measurements, such as D1 and PsbO protein content or O2-evolving activity, as reported in previous stud- ies [52,53]. Despite this limitation, the OJIP-test remains a sensitive, non-invasive tool for early detection of physiological alterations induced by viral infection. Complementary findings from the JIP test revealed that viral infection disrupts chloro- phyll biosynthesis, leading to leaf yellowing consistent with the observations of [15] in ScYLV-infected sugarcane plants. Similarly, PRSV-P induces severe mosaic symptoms in papaya and causes structural alterations in PSII, including increased chlorophyll a fluo- rescence polarization, suggesting pathogen-induced thylakoid membrane transformation. Such modifications in the physical state of the thylakoid affect pigment protein topology and impair energy transfer from carotenoids to chlorophylls [26]. Our results corroborate these findings, indicating that both PRSV-P and PMeV alter chloroplast structure and photochemical function, resulting in reduced photon utilization and PSII activity. These effects are reflected in changes in the O J phases (appearance of K and L bands), the IP phase (H and G bands), and the electron transfer between QA and QB, evidenced by an increase in the PSI electron acceptor pool ( R0, RE0/CS0). Consequently, higher PITOTAL values were observed in both younger asymptomatic and older symptomatic plants. Even in asymptomatic plants (A/MAY), alterations in K and L-bands indicate that viral replication already affects OEC function and photosynthetic efficiency, demonstrating that fluorescence can detect infection before visible symptoms. High PSI efficiency ( R0, R0, RE0/CS0, DFTOTAL) detected by the chlorophyll a fluorescence method may already indicate alterations before symptoms are noticeable, as observed in A/MAY plants in which, although the presence of the PMeV virus was confirmed, visible symptoms were not observed. Another relevant factor for the presence of the virus even in asymptomatic plants is the low initial viral load, which may limit the immediate impact on chloroplast organization and chlorophyll production, as may be the case in young asymptomatic plants evaluated 13 months after planting (A/MAY). In addition, some viruses have the ability to modulate the response to oxidative stress, reducing the damage caused in the early stages of infec- tion [54]. Even with this regulation, the efficiency of PSII may be compromised, resulting in changes in chlorophyll a fluorescence, even if visible symptoms only appear later. The increased oxidative stress in plants with mixed infections may result not only from general metabolic disruption but also from direct viral protein interactions with chloroplast enzymes, impairing photoprotective mechanisms and promoting energy dissipation as heat, as previously highlighted for virus-infected papaya [44,55,56]. 39 Plants 2025, 14, 3208 PCR detection of PRSV-P and PMeV (Figures 4 7) confirmed the presence of viral pathogens in the plants analyzed for chlorophyll a fluorescence, supporting the physio- logical alterations observed in the OJIP parameters. The coincidence between PCR results and specific fluorescence band changes indicates that these patterns reflect distinct stages of the viral cycle and their effects on photosynthesis. Coinfection by multiple viruses may intensify oxidative stress, increasing energy dissipation as heat, which is detectable through fluorescence measurements. These results reinforce that the observed changes in PSII and PSI performance are attributable to viral infection rather than other environmental or biotic factors. Although this study was not intended to establish a diagnostic protocol, it demonstrates the potential of chlorophyll a fluorescence as an early physiological indicator of infection. Further studies integrating fluorescence analyses with broader molecular and biochemical assays will help validate and refine this approach for early detection and for elucidating how mixed viral infections influence plant metabolism [44,55,56]. It is important to emphasize that the physiological alterations detected by chlorophyll a fluorescence were corroborated by PCR-based detection of PRSV-P and PMeV in the same samples. The PCR results confirm that changes in fluorescence parameters are associated with viral infection. Therefore, our findings should be interpreted as an exploratory demonstration of early physiological responses rather than a validated diagnostic protocol. Further validation against established detection methods such as ELISA and multiplex RT-PCR will be essential before this approach can be reliably used for early virus detection in the field. The results further indicate that the PRSV-P and PMeV infections can be used to understand the complexities involved at the molecular level, and the experiments, par- ticularly the measurement of induction kinetics, can be used for rapid assessment of the pathophysiological state of plants subjected to biotic stress. 4. Materials and Methods 4.1. Experimental Area and Plant Material This study was carried out on the papaya cv. Aliança, and the analyses were per- formed at two sites over three distinct periods of plant development. The first data collection was carried out in October 2022 in Rio Quartel, Linhares, ES (19 31 21.8 S 40 13 01.1 W/ 19.522716, 40.216967). The plants were in the fruiting stage at approxi- mately 24 months after planting and presented severe symptoms of papaya mosaic and sticky diseases. Immediately after data and sample collection, the plants were exterminated following Normative Instruction No. 17 of the Ministry of Agriculture, Livestock and Food Supply (MAPA), on 27 May 2010. The analyses were performed on 10 plants per treatment. The 2nd and 3rd collections were carried out in the municipality of Guaraná, Aracruz, ES (19 38 S 40 15 W/ 19.639578, 40.251265). In December 2022 and May 2023, samples were collected from healthy plants (A) and from symptomatic plants (S). During the second collection, the plants were 8 months old and in their first fruiting. During the third collection, the crop was sampled at 13 months after planting. The treatment groups described in the text were as follows: A/DEC = asymptomatic leaves from plants 8 months after planting (sampled in December 2022), A/MAY = asymptomatic leaves from plants 13 months after planting (sampled in May 2023), S/DEC = symptomatic leaves from plants 8 months after planting (sampled in December 2022), S/MAY = symptomatic leaves from plants 13 months after planting (sampled in May 2023), and SG/OCT = leaves with severe viral infection symptoms from plants 24 months after planting (sampled in October 2022). Leaf samples from healthy plants were also collected from plantations where care was taken to detect the first symptoms of viral infection daily. 40 Plants 2025, 14, 3208 4.2. Transient Chlorophyll a Fluorescence To analyze the transient fluorescence of chlorophyll a, a portable fluorometer (Handy- Analyses were per- formed on fully expanded leaves in the early morning hours to avoid the inhibitory effects of high temperature and light on photosynthetic reactions. Measurements were performed on 10 plants per experiment, with five readings taken per leaf. Leaves were acclimated in the dark for 40 min (at which time all photosystem reaction centers were fully oxi- dized). After dark acclimation, the leaves were exposed to a saturating amount of red light (3000 µmol m 2 s 1). The fluorescence intensities were recorded between 20 µs and 1 s, where 20 µs was the timepoint for the initial fluorescence (F0) and ±300 ms was the maxi- mum fluorescence (FM). The fluorescence intensity data were normalized to the relative fluorescence (Vt), where Vt = (Ft FM)/(FM F0). The differences among plants from the three data collections were calculated using the results for A/DEC plants (asymptomatic leaves of plants 8 months after planting, sampled in December 2022) as a reference to obtain Vt = F (treatment) F (reference) [57]. The established parameters were calculated on the basis of the fluorescence intensities via the JIP test [47] (Supplementary Table S1). 4.3. Chlorophyll Index The total chlorophyll index was determined with the same leaves used for photo- chemical performance measurements using a portable chlorophyll meter (SPAD-502 Plus, Konica Minolta Optics Inc., Osaka, Japan). This instrument provides a convenient and low-cost method for measuring the relative chlorophyll content of a leaf sample using dual-wavelength (at 620 and 940 nm) optical absorbance measurements [58]. 4.4. Molecular Diagnostics The same leaf samples from ten plants, which were used to determine chlorophyll indices and chlorophyll a fluorescence, were also used to assess the presence of viruses associated with mosaic and bacterial blight symptoms, following established molecular methodologies described in previous studies [8,38,59]. For molecular analysis, leaf tissue from each plant was collected and pooled to ensure sufficient material and reproducibility of RNA extraction. Total RNA was extracted using TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, Taq DNA Polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), following the instructions. Additionally, leaf samples from asymptomatic plants at the cultivation sites, which were subjected to daily surveillance, were collected for early detection of viral infection symptoms. 4.5. Experimental Design and Statistical Analysis The experiment was performed with a completely randomized design with two treatment groups, asymptomatic plants and symptomatic plants, evaluated at three stages of development: 8 months after planting (December 2022), 13 months after planting (May 2023) and 24 months after planting (October 2022). Each plant was designated as an independent experimental unit. The collected data were subjected to analysis of variance (ANOVA) to assess treatment effects. When ANOVA yielded significant F values ( = 0.05), mean comparisons were using INFOSTAT statistical software (2020, Grupo Infostat, Córdoba, Argentina). 41 Plants 2025, 14, 3208 5. Conclusions Chlorophyll a fluorescence measurements revealed detailed physiological responses of papaya plants under PMeV and PRSV-P coinfection. Changes in PSII electron transport (DFABS) and in multiple turnover steps (J I, I P; positive K, L, H, and G bands), and de- creases in PSI efficiency ( R0, RE0/CS0), were detected not only in symptomatic plants but also in asymptomatic individuals, with patterns influenced by plant age and developmental stage. These findings indicate that subtle alterations in the performance of photosystems II and I may precede visible symptoms of infection. Although infected young plants initially exhibit an increase in PSI efficiency and overall performance (PITOTAL), PSII is affected early, resulting in reduced PIABS as infection progresses. Therefore, chlorophyll a fluorescence provides a sensitive, rapid approach to monitor the pathophysiological state of plants under biotic stress, potentially allowing early detection of viral infection, providing an exploratory physiological indicator. Nevertheless, we emphasize that OJIP-based screening should be complemented with molecular or biochemical assays to confirm infection and fully understand the underlying mechanisms. Supplementary Materials: The following supporting information can be downloaded at https: //www.mdpi.com/article/10.3390/plants14203208/s1. Author Contributions: Investigation and methodology: W.P.d.M.; investigation, data curation: O.d.F.Q.; writing original draft, writing review & editing: S.G.B.; visualization, validation: J.A.V.; supervision, writing reviewing and editing, project administration: D.M.S. All authors have read and agreed to the published version of the manuscript. Funding: J.A.V. acknowledges the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) for their research productivity award (#308306/2021-0 and #307905/2020-9). This research was supported by the Fundação de Amparo à Pesquisa do Espírito Santo (FAPES) (grant number 269). W.P.M acknowledges the financial support from Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (grant number 160664/2020-9). Data Availability Statement: Data are contained within the article and Supplementary Materials. Acknowledgments: We deeply thank Mirielson Loures da Silva for providing technical support. Conflicts of Interest: The authors declare no conflicts of interest. References 1. FAO. Major Tropical Fruits Market Review Preliminary Results 2023, 1st ed.; FAO: Rome, Italy, 2024; Available online: https:// openknowledge.fao.org/server/api/core/bitstreams/c03844d3-3dc6-4465-abf3-8c49947e77d8/content (accessed on 1 December 2024). 2. Abreu, P.M.V.; Gaspar, C.G.; Buss, D.S.; Ventura, J.A.; Ferreira, P.C.G.; Fernandes, P.M.B. Carica papaya MicroRNAs Are Responsive to Papaya meleira virus Infection. PLoS ONE 2014, 9, e103401. [CrossRef] 3. 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