UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO CENTRO UNIVERSITÁRIO NORTE DO ESPÍRITO SANTO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA TROPICAL MARIA LUIZA PEREIRA BARBOSA PINTO EFEITO DO ALAGAMENTO NAS RESPOSTAS MORFOFISIOLÓGICAS EM MUDAS DE CACAUEIRO (Theobroma cacao L.) São Mateus – ES Fevereiro de 2020 UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO CENTRO UNIVERSITÁRIO NORTE DO ESPÍRITO SANTO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA TROPICAL EFEITO DO ALAGAMENTO NAS RESPOSTAS MORFOFISIOLÓGICAS EM MUDAS DE CACAUEIRO (Theobroma cacao L.) MARIA LUIZA PEREIRA BARBOSA PINTO Dissertação apresentada à Universidade Federal do Espírito Santo, como parte das exigências do Programa de Pós- Graduação em Agricultura Tropical, para a obtenção do título de Mestre em Agricultura Tropical. Orientadora: Profª. Drª. Sara Dousseau Arantes São Mateus–ES Fevereiro de 2020 SUMÁRIO 1.1 Efeito do alagamento nos aspectos fisiológicos e metabólicos em mudas de cacaueiro (Theobroma cacao L.)..................................................1 1.2 Análise da atividade fotossintética de genótipos de Theobroma cacao L. em condição de alagamento.......................................................................2 Resumo..............................................................................................................3 1.2.1 Introdução..................................................................................................5 1.2.2 Material e Métodos....................................................................................7 1.2.3 Resultados.................................................................................................9 1.2.4 Discussão.................................................................................................15 1.2.5 Conclusão.................................................................................................19 1.2.6 Referências...............................................................................................20 1.3 Adaptações anatômicas e de desenvolvimento de Theobroma cacao L. para tolerância a hipóxia.................................................................................26 1 CAPÍTULO 1 Efeito do alagamento nos aspectos fisiológicos e metabólicos em mudas de cacaueiro (Theobroma cacao L.) 2 CAPÍTULO 2 Análise da atividade fotossintética de genótipos de Theobroma cacao L. em condição de alagamento 3 Resumo PINTO, Maria Luiza Pereira Barbosa; M.Sc.; Universidade Federal do Espírito Santo; Fevereiro de 2020; Análise da atividade fotossintética de genótipos de Theobroma cacao L. em condição de alagamento; Orientadora: Sara Dousseau Arantes; Coorientadores: Carlos Alberto Spaggiari Souza e José Altino Machado Filho. O cacaueiro (Theobroma cacao L.) é uma planta de origem na América Tropical, no município de Linhares-ES é cultivado em solos aluviais que são propícios ao alagamento no verão quando as chuvas são intensas e frequentes. Quando cultivadas em alagamento as plantas estão sujeitas a hipoxia ou a anoxia, o oxigênio é fundamental em diversos processos que ocorrem na planta, como a respiração e síntese de clorofila. O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência fotoquímica em mudas de cacaueiro de cinco genótipos submetidos ao estresse por alagamento do substrato. As plantas foram submetidas ao alagamento por 60 dias. Nos períodos de 0, 19 e 55 dias após o alagamento foram realizadas avaliações de fluorescência da clorofila “a” e no final do experimento foi realizado a extração de pigmentos fotossintéticos. Em todos os genótipos estudados sob o alagamento foi percebido o aparecimento da banda K e da banda L. Após 19 e 55 dias alagado não foi encontrado diferenças significativas entres os genótipos Esfip-02, Pará, Cepec- 2002, TSH-1188 e SJ-02 para os parâmetros JIP analisados. Embora não tenha havido interação significativa entre genótipos e ambiente, os teores de pigmentos foram reduzidos significativamente no ambiente com hipóxia. Após o período do alagamento pode-se concluir que para os parâmetros avaliados não foi possível detectar qual o genótipo mais resistente, visto que não houve diferença estatística entre os genótipos, apenas para o pigmento carotenoides o Esfip-02 foi o que apresentou maior resultado. Palavras-chave: anoxia, fluorescência, pigmentos, cacau 4 Abstract PINTO, Maria Luiza Pereira Barbosa; M.Sc.; Universidade Federal do Espírito Santo; Fevereiro de 2020; Análise da atividade fotossintética de genótipos de Theobroma cacao L. em condição de alagamento; Orientadora: Sara Dousseau Arantes; Coorientadores: Carlos Alberto Spaggiari Souza e José Altino Machado Filho. Cacao (Theobroma cacao L.) is a plant of origin in Tropical America, in the municipality of Linhares-ES. It is cultivated in alluvial soils that are prone to flooding in the summer when rainfall is intense and frequent. When cultivated in flooding plants are subject to hypoxia or anoxia, oxygen is critical in various processes that occur in the plant, such as respiration and chlorophyll synthesis. The objective of this work was to evaluate the photochemical efficiency in cacao seedlings of five genotypes submitted to stress by substrate flooding. The plants were flooded for 60 days. At 0, 19 and 55 days after flooding, fluorescence evaluations of chlorophyll “a” were performed and photosynthetic pigments were extracted at the end of the experiment. In all genotypes studied under flooding, the appearance of K band and L band was observed. After 19 and 55 days flooded, no significant differences were found between the Esfip-02, Pará, Cepec-2002, TSH-1188 and SJ- 02 for the analyzed JIP parameters. Although there was no significant interaction between genotypes and environment, pigment contents were significantly reduced in the hypoxic environment. After the flooding period, it can be concluded that for the evaluated parameters it was not possible to detect which genotype was the most resistant, since there was no statistical difference between the genotypes. Only for the carotenoid pigment, Esfip-02 presented the highest result. Keywords: anoxia, fluorescence, pigments, cocoa 5 1.2 Análise da atividade fotossintética de genótipos de Theobroma cacao L. em condição de alagamento Introdução O cacaueiro (Theobroma cacao L.) é uma planta propagada por semente, de clima quente e úmido (Sánchez, 2011), de origem na América Tropical (Machado, 2019). O Estado do Espírito Santo é o terceiro maior produtor de cacau no Brasil (IBGE, 2018), e dentro do estado o município de Linhares é o maior produtor com 5.266 mil toneladas (IBGE, 2017). A maior parte do cacau plantado na região Norte do Espírito Santo se concentra no município de Linhares, onde é cultivado em solos aluviais que são propícios ao alagamento no verão quando as chuvas são intensas e frequentes (Souza et al., 2005). Quando cultivadas em alagamento as plantas estão sujeitas a hipoxia (baixa disponibilidade de O2) ou a anoxia (completa ausência de O2) (Sauter, 2013) com isso produzem sinais metabólicos como alteração do metabolismo celular, além de mudanças nas características físico-químicas e biológicas do solo gerando alterações na fisiologia, na morfologia e na anatomia das plantas afetando a respiração das raízes (Parolin, 2001). As primeiras respostas fisiológicas observadas em cacaueiros são o fechamento dos estômatos, a diminuição da transpiração e a diminuição da taxa de assimilação de carbono (Rehem et al., 2010; Bertolde et al., 2012), ocorrendo também a clorose de folhas maduras devido à deficiência de nitrogênio (Rehem et al., 2010), a inibição da expansão e formação de folhas, ramos e, principalmente raízes dos cacaueiros (Rehem et al., 2009). Quando um campo é inundado, os níveis de O2 na superfície da raiz decrescem drasticamente, nessas condições, a respiração nas raízes é suprimida, e a fermentação é aumentada. Essa mudança metabólica pode provocar acumulo de etanol, como consequência do esgotamento de energia, muitos processos são suprimidos (Taiz, 2017) como a respiração e síntese de clorofila. Plantas intolerantes ao encharcamento apresentam redução na atividade fotossintética devido à baixa concentração interna de CO2 nas folhas causada pela limitação estomática (Branco et al., 2017) . 6 Quando ocorrem restrições na etapa bioquímica, a energia luminosa não é totalmente absorvida pelas moléculas de clorofila, sendo então perdidas na forma de calor ou como fluorescência da clorofila a (Araújo et al., 2019). A análise de fluorescência da clorofila a é uma técnica que detecta alterações no FSII (Mehta et al., 2010; Strasser et al., 2010), é um método que esta sendo bastante utilizado por ser sensível, rápido e principalmente não destrutivo (Yusuf et al., 2010). Este método fornece informações sobre os processos e alterações que ocorrem nos tilacóides dos cloroplastos e sobre a transferência de luz na cadeia transportadora de elétrons (Yusuf et al., 2010; Thoren et al., 2010) permitindo assim estimar a eficiência do fotossistema II em processos fotoquímicos e não-fotoquímicos (Rohácek, 2002). O aparelho fotossintético é extremamente sensível ao estresse, à emissão de fluorescência da clorofila a vem sendo utilizado com um indicador do grau de tolerância das plantas a estresses abióticos através da integridade e funcionalidade do aparato fotossintético (Yusuf et al., 2010; Sousa et al., 2014). O estresse por alagamento causa danos no fotossistema, assim através da fluorescência emitida pelas plantas é possível detectar os sintomas deste estresse (Yusuf et al., 2010; Romero et al., 2010). Além do uso da fluorescência para detectar danos causados pelo alagamento, os pigmentos que são importantes para a sobrevivência das plantas também podem ser utilizados para avaliação da eficiência fotossintética, visto que são responsáveis pelo controle da absorção da luz durante a fotossíntese (Kluge et al., 2015; Daniel et al., 2016). A avaliação da eficiência fotoquímica obtida por meio da fluorescência da clorofila “a” permite um diagnóstico fisiológico mais sensível que a concentração de pigmentos foliares (Silva et al., 2015), porém o uso das duas técnicas permite uma visão mais ampla da aparato fotossintético. Dessa forma estudos sobre os parâmetros da eficiência fotossintética e acumulo de pigmentos contribuem para o conhecimento da espécie Theobroma cacao submetidas às condições ambientais de alagamento, considerando que alta pluviosidade causa encharcamento dos solos, principalmente quando cultivados na beira de rios. Como o cacaueiro é uma planta exigente de solos bem drenados, o objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência fotoquímica em 7 mudas de cacaueiro de cinco genótipos submetidos ao estresse por alagamento do substrato. Materiais e métodos O experimento foi conduzido de maio a junho de 2019 na Fazenda Experimental do Instituto Capixaba de Pesquisa Assistência Técnica e Extensão Rural (INCAPER), localizada no município de Linhares-ES, a uma latitude Sul de 19º23'59'' e uma longitude de 40º04'01''W. Os genótipos utilizados foram TSH-1188, CEPEC 2002, Pará, ESFIP- 02, SJ-02 como porta-enxerto, e o genótipo PS-1319 como copa. As mudas foram produzidas conforme Sodré (2013) de propágulos obtidos de plantas matrizes do Banco Ativo de Germoplasma da CEPLAC. Após sete meses da formação das mudas foram transplantadas para sacolas de polietileno preto (25 x 35 cm), e levadas para a aclimatação em tanques de alvenaria revestidos com lona branca e cobertos com sombrite (50% de sombreamento) durante 60 dias antes da submissão dos tratamentos. O delineamento foi em blocos casualizados, com quatro repetições por tratamento, esquema fatorial 5 x 2, correspondendo a cinco porta-enxertos e duas condições (alagado e não alagado). As plantas foram submetidas ao alagamento por 60 dias, de modo que o nível de água permaneceu acima do substrato, e como controle plantas não alagadas. As avaliações foram realizadas em duas plantas por repetição. Nos períodos de 0, 19 e 55 dias após o alagamento foram realizadas avaliações de fluorescência da clorofila “a” entre 07:00 e 10:00 h da manhã utilizando folhas completamente expandidas na porção mediana da planta, no terceiro nó de uma folha por planta, no final do experimento foi realizado a extração de pigmentos fotossintéticos. A fluorescência transiente polifásica (OJIP) da clorofila “a” foi medida com auxílio do fluorímetro portátil (Handy-Plant Efficiency Analyser, Hansatech Instruments, King’s Lynn, Norfolk, UK) com um pulso de irradiância saturante de 3000 mmol m-2s-1 de fótons, as folhas foram adaptadas ao escuro por 30 minutos, utilizando-se clipes foliares apropriados, a fim de permitir a completa oxidação do sistema fotossintético de transporte de elétrons, a partir das 8 intensidades de fluorescência foram calculados os parâmetros do teste JIP (Strasser, Strasser, 1995), através do software Biolyzer (Laboratório de Bioenergética, Universidade de Genebra, Suíça). As curvas OJIP foram normalizadas como fluorescência relativa entre os pontos O-K [VOK = (FT-FO) / (FK-FO)]; fluorescência relativa entre os pontos O-J [VOJ = (FT-FO) / (FJ-FO)]. Através das fluorescências relativa (VOK e VOJ) foi calculado as diferenças cinéticas entres as plantas controle e as submetidas ao estresse (ΔV = V tratamento – V controle), sendo possível revelar as bandas K e L. A determinação dos teores de clorofila e carotenóides foram realizados ao final do experimento, a partir de duas folhas completamente expandidas do terceiro nó abaixo do ápice das plantas, escolhidas ao acaso. No momento da coleta as folhas foram acondicionadas em caixas de isopor refrigeradas com gelo até serem transferidas ao laboratório. A extração e quantificação das clorofilas, a, b e total foram realizadas segundo a metodologia de ARNON (1949). A extração e quantificação de carotenóides totais foram realizadas de acordo com a metodologia descrita por Duke & Kenyon (1986), utilizando os coeficientes de absortividade molar de Sandman & Borger (1983). A análise estatística para o experimento foi feita pelo programa SISVAR (Ferreira, 2000), após análise de variância as médias foram comparadas pelo teste de Tukey ao nível de significância de 5%. Parâmetros do teste JIP: Fo – Fluorescência mínima Fm – Fluorescência máxima Fv – Fluorescência variável VJ – Fluorescência variável relativa no passo J ABS/RC - Fluxo específico de absorção por centro de reação ativo DI0/RC - Fluxo específico de dissipação por centro de reação ativo ET0/RC - Fluxo específico de transporte de elétrons por centro de reação ativo PIABS - Índice de desempenho relativo à absorção TR0/RC - Fluxo específico de captura por centro de reação ativo φPo - Rendimento quântico máximo da fotoquímica primária φDo - Rendimento quântico da dissipação de energia φEo - Rendimento quântico do transporte de elétrons 9 QA - Quinona A QB – Quinona B RC - Centro de reação Resultados Para avaliar diferenças entre os genótipos foi necessário uso de normalizações que permitiram o aparecimento das bandas K e bandas L. Os dados foram normalizados entre os pontos O e J [0,02 e 2 ms, sendo VOJ= (FT–F0) / (FJ–F0)] e na diferença cinética ΔVOJ = VOJ(tratamento) –VOJ(controle) (figura 1A á 1E) e entre os pontos O e K [0,02 e 0,3 ms, sendo [VOK= (FT–F0) / (FK-F0)]e apresentados como a diferença cinética ΔVOK = VOK(tratamento) – VOK(controle) (Figura 1F á 1J). Através das normalizações foi possível observar a presença de banda K positiva em todos os genótipos avaliados, com 19 dias após o alagamento os genótipos Para, Tsh-1188, Cepec-2002 apresentaram bandas positivas, seguido de um aumento na amplitude aos 55 dias após alagamento (figura 1A, 1B e 1D), enquanto que o genótipo Sj-02 apresentou a mesma amplitude de banda aos 19 e 55 dias após alagamento (figura 1E), e o genótipo Esfip-02 com zero dias de alagamento apresentou um comportamento diferente com o aparecimento da banda K antes da submissão ao estresse (figura 1C). Em todos os genótipos estudados sob as condições de alagamento foi percebido o mesmo comportamento, revelando a banda L. os genótipos Tsh- 188, Cepec-2002 e Para apresentando o mesmo comportamento, com amplitudes maiores aos 55 dias após o alagamento (figura 1F, 1G e 1I), o Sj-02 apresentou amplitude maior com 19 dias após alagamento (figura 1J), e o Esfip-02 foi o único genótipo que apresentou banda positiva com zero dia (figura 1H). 10 Figura 1: Fluorescência transiente da clorofila a de folhas adaptadas ao escuro em diferentes genótipos de cacaueiro (Theobroma cacao L.), Para (figura A-F), TSH-1188 (figura B-G), Esfip-02 (figura C-H), Cepec-2002 (figura D-I) e SJ-02 (figura E-J). (A-E) fluorescência variável entre os pontos O e J [VOJ = (FT - F0)/(FJ - F0)] e diferença cinética de VOJ [ΔVOJ = (VOJ alagada – VOJ controle)]; (F-J) fluorescência variável entre os pontos O e K [VOK = (FT - F0)/(FK - F0)] e diferença cinética de VOK [ΔVOK = VOK alagada - VOK controle)], em três períodos zero, 19 e 55 dias durante alagamento (AL) e sem alagamento (NA). 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 V O J = ( F T -F O ) / (F J -F O ) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 V O J -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,0 0,1 0,2 0,3 V O K = ( F T -F O ) / (F K -F O ) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 V O K -0,10 -0,05 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 V O J = ( F T -F O ) / (F J -F O ) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 V O J -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,0 0,1 0,2 0,3 V O K = ( F T -F O ) / (F K -F O ) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 V O K -0,10 -0,05 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 V O J = ( F T -F O ) / (F J -F O ) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 V O J -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,0 0,1 0,2 0,3 V O K = ( F T -F O ) / (F K -F O ) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 V O K -0,10 -0,05 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 V O J = ( F T -F O ) / (F J -F O ) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 V O J -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,0 0,1 0,2 0,3 V O K = ( F T -F O ) / (F K -F O ) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 V O K -0,10 -0,05 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 Tempo (ms) 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 V O J = ( F T -F O ) / (F J -F O ) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 V O J -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 Tempo (ms) 0,0 0,1 0,2 0,3 V O K = ( F T -F O ) / (F K -F O ) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 V O K -0,10 -0,05 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 NA zero dia AL zero dia NA 19 dias AL 19 dias NA 55 dias AL 55 dias NA zero dia AL zero dia NA 19 dias AL 19 dias NA 55 dias AL 55 dias A - Para F - Para B - TSH-1188 G - TSH-1188 C - Esfip-02 H - Esfip-02 D - Cepec-2002 I - Cepec-2002 E - SJ-02 J - SJ-02 11 Para o dia zero de alagamento no parâmetro referente à fluorescência inicial (Fo) o Esfip-02 quando comparado aos demais genótipos apresentou fluorescência inicial maior, quando os genótipos foram comparados em relação ao ambiente o TSH-1188 foi maior no não alagado, o mesmo comportamento foi encontrado no parâmetro VJ (tabela 1). Parâmetros referentes ao fluxo específico ou fluxo por centro de reação (RC) no FSII mostram que houve diferença entre os genótipos no ambiente alagado no dia zero de alagamento. O fluxo de elétrons absorvidos por centro de reação (ABS/RC), a capacidade de captura de elétrons por centro de reação (TRO/RC) e o fluxo específico de dissipação por centro de reação ativo (DIO/RC) se mostraram maiores para o genótipo Esfip -02. Quando comparados entre os ambientes os genótipos Esfip-02 e TSH-1188 mostraram valores maiores no não alagado (tabela 1). Para o parâmetro rendimento quântico da dissipação de energia (φDo) o genótipo Esfip-02 apresentou maior valor quando comparado com os outros genótipos, sugerindo que no momento da leitura este genótipo estava dissipando energia na forma de calor. Quando os genótipos foram comparados com os ambientes o TSH-1188 e o SJ-02 foram os únicos que apresentaram diferenças entre alagado e não alagado, onde plantas não alagados demostraram maior perda de energia na forma de calor (tabela 1). Tabela 1: Parâmetros fotossintéticos derivados da análise JIP de plantas controle não alagadas (NA) e plantas alagadas (AL) avaliados no dia zero antes do alagamento. (Fo) Fluorescência mínima; (VJ) fluorescência variável relativa no passo J; (φDo) rendimento quântico da dissipação de energia; (ABS/RC) fluxo específico de absorção por centro de reação ativo; (TRO/RC) fluxo específico de captura por centro de reação ativo; (DIO/RC) fluxo específico 12 de dissipação por centro de reação ativo. Médias seguidas pela mesma letra maiúscula na coluna e minúscula na linha não diferem entre si dentro de cada ambiente (alagado e não alagado) e entre genótipos, respectivamente, a 5% de probabilidade, pelo teste de Tukey. Não foram encontradas diferenças significativas para os parâmetros fluorescência máxima (Fm), fluorescência variável (Fv), rendimento quântico máximo da fotoquímica primária (φPo), rendimento quântico do transporte de elétron (φEo), (ETO/RC) fluxo específico de transporte de elétrons por centro de reação ativo e (PIABS) índice de performance relativo a absorção quando comparados entre genótipos e entre ambientes durante o dia zero de alagamento (tabela 2). Tabela 2: Parâmetros fotossintéticos derivados da análise JIP de plantas controle não alagadas (NA) e plantas alagadas (AL) avaliados com zero dia alagado. Fluorescência máxima (Fm); fluorescência variável (Fv); rendimento quântico máximo da fotoquímica primária (φPo); rendimento quântico do transporte de elétron (φEo); (ETO/RC) fluxo específico de transporte de elétrons por centro de reação ativo e (PIABS) índice de performance relativo a absorção. Médias seguidas pela mesma letra na linha, entre genótipos e entre ambientes, não diferem entre si a 5% de probabilidade, pelo teste de Tukey. Após 19 e 55 dias alagado não foi encontrado diferenças significativas entres os genótipos Esfip-02, Pará, Cepec-2002, TSH-1188 e SJ-02 para os parâmetros analisados, mostrando que não existem diferenças entre os Parâmetro Tratamento Esfip-02 Para Cepec-2002 TSH-1188 SJ-02 NA 826,5 Aa 790,25 Aa 933,0 Aa 1071,375 Aa 879,625 Aa AL 1019,25 Aa 925,25 Aab 809,625 Aab 679,875 Bab 653,25 Ab NA 0,68625 Aa 0,63635 Aa 0,735 Aa 0,80625 Aa 0,73 Aa AL 0,751250 Aa 0,7325 Aa 0,695 Aa 0,60875 Ba 0,5775 Aa NA 0,33125 Aa 0,31375 Aa 0,38125 Aa 0,4025 Aa 0,34375 Aa AL 0,40875 Aa 0,3625 Aab 0,33125 Aab 0,28 Bb 0,25 Bb NA 3,0325 Ba 3,04125 Aa 3,58 Aa 3,96125 Aa 3,29125 Aa AL 4,07125 Aa 3,49875 Aab 3,12875 Aab 2,64 Bb 2,38 Ab NA 2,01625 Aa 1,90875 Aa 2,12875 Aa 2,25875 Aa 2,1475 Aa AL 2,3475 Aa 2,1225 Aab 2,0375 Aab 1,79375 Bab 1,69875 Ab NA 1,01875 Ba 1,13375 Aa 1,44625 Aa 1,70125 Aa 1,1425 Aa AL 1,725 Aa 1,375 Aab 1,0875 Aab 0,845 Bab 0,68125 Ab Genótipo Fo VJ φ Do ABS/RC TRo/RC DIo/RC Parâmetros Esfip-02 Para Cepec-2002 TSH-1188 SJ-02 NA AL Fm 3010,0625 a 2885,125 a 2926,6875 a 2900,3125 a 3011,0625 a 3005 a 2888,4 a Fv 2087,4375 a 2027,375 a 2055,375 a 2024,6875 a 2244,625 a 2104,85 a 2070,95 a φPo 0,63 a 0,599375 a 0,64375 a 0,59625 a 0,64125 a 0,62075 a 0,6235 a φEo 0,18 a 0,168125 a 0,191875 a 0,15375 a 0,195625 a 0,16875 a 0,187 a ETo/RC 0,593125 a 0,5275 a 0,569375 a 0,485625 a 0,57625 a 0,53375 a 0,567 a PIABS 2,540625 a 2,67125 a 3,879375 a 2,170625 a 3,433125 a 2,611 a 3,267 a Genótipo Tratamento 13 genótipos estudados quando são submetidos ao alagamento (tabela 3). Porém quando comparados em relação ao ambiente tanto aos 19 quanto aos 55 dias alagado aumentos na absorção (ABS/RC) e na captura de elétrons (TRO/RC) foram observadas no ambiente alagado, o que significa que a inativação dos centros de reação foi reduzida, no entanto com o aumento do DIO/RC e do φDo houve um aumento na dissipação na forma de calor durante o alagamento quando comparados ao controle não alagado, seguido de uma redução no fluxo de transporte de elétrons (ETO/RC) (tabela 4). Nos parâmetros Fo e VJ houve um aumento crescente dos 19 aos 55 dias alagado, mostrando que o alagamento afetou negativamente o fluxo de elétrons de QA para QB, comprometendo a cadeia transportadora de elétrons. Para os parâmetros Fm, Fv, φPo, φEo e PIABS houve uma redução a medida que a planta ficou mais tempo exposta ao estresse, confirmando que as plantas quando submetidas ao alagamento sofrem danos nos aceptores de elétrons, reduzindo assim a atividade do FSII apresentando um menor desempenho fotossintético (tabela 4). Tabela 3: Parâmetros fotossintéticos derivados da análise JIP de genótipos de Theobroma cacao L. avaliados com 19 e 55 dias alagado. (Fo) Fluorescência mínima; fluorescência máxima (Fm); fluorescência variável (Fv); (VJ) fluorescência variável relativa no passo J; rendimento quântico máximo da fotoquímica primária (φPo); rendimento quântico do transporte de elétron (φEo); (φDo) rendimento quântico da dissipação de energia; (ABS/RC) fluxo específico de absorção por centro de reação ativo; (TRO/RC) fluxo específico de captura por centro de reação ativo; (ETO/RC) fluxo específico de transporte de elétrons por centro de reação ativo; (DIO/RC) Fluxo específico de dissipação por centro de reação ativo e (PIABS) índice de performance relativo a absorção. Médias seguidas pela mesma letra na linha entre genótipos não diferem entre si a 5% de probabilidade, pelo teste de Tukey. Parâmetro Esfip-02 Para Cepec-2002 TSH-1188 SJ-02 Esfip-02 Para Cepec-2002 TSH-1188 SJ-02 Fo 763,25 a 732,3125 a 837,8125 a 711,3125 a 798,9375 a 791,0625 a 867,625 a 872,9375 a 807,25 a 825,875 a Fm 3040,9375 a 3026,5 a 2885,1875 a 2863,0625 a 2868, 0625 a 2991,25 a 2910 a 2732,6875 a 2894,1875 a 2920,9375 a Fv 2277,6875 a 2294,1875 a 2047,375 a 2151,75 a 2069,125 a 2200,1875 a 2042,375 a 1859,75 a 2086,9375 a 2095,0625 a VJ 0,62 a 0,643125 a 0,6575 a 0,650625 a 0,64875 a 0,60375 a 0,656875 a 0,646875 a 0,643125 a 0,62625 a φ Po 0,69875 a 0,701875 a 0,648125 a 0,69375 a 0,65875 a 0,676875 a 0,631875 a 0,61625 a 0,645 a 0,65125 a φ Eo 0,27375 a 0,2575 a 0,23375 a 0,246875 a 0,244375 a 0,281875 a 0,240625 a 0,23625 a 0,246875 a 0,2575 a φDo 0,30125 a 0,298125 a 0,351875 a 0,30625 a 0,34125 a 0,323125 a 0,368125 a 0,38375 a 0,355625 a 0,34875 a ABS/RC 2,96125 a 3,014375 a 3,3525 a 2,990625 a 3,54875 a 3,2175 a 5,11875 a 4,2825 a 3,91625 a 3,66125 a TRO/RC 1,95125 a 2,00375 a 2,043125 a 2,010625 a 2,0675 a 1,999375 a 2,10625 a 2,10625 a 2,060625 a 2,108125 a ETO/RC 0,71625 a 0,68625 a 0,67625 a 0,681875 a 0,683125 a 0,739375 a 0,66125 a 0,68875 a 0,68125 a 0,73 a DIO/RC 1,009375 a 1,011875 a 1,3075 a 0,98 a 1,481875 a 1,21875 a 3,01 a 2,176875 a 1,856875 a 1,555 a PIABS 8,25 a 6,725 a 6,008125 a 5,855625 a 6,8825 a 10,53125 a 7,2025 a 7,593125 a 7,970625 a 9,19 a Genótipo 55 dias alagado Genótipo 19 dias alagado 14 Tabela 4: Parâmetros fotossintéticos derivados da análise JIP de plantas não alagadas (NA) e alagadas (AL) avaliados com 19 e 55 dias alagado. (Fo) Fluorescência mínima; fluorescência máxima (Fm); fluorescência variável (Fv); (VJ) fluorescência variável relativa no passo J; rendimento quântico máximo da fotoquímica primária (φPo); rendimento quântico do transporte de elétron (φEo); (φDo) rendimento quântico da dissipação de energia; (ABS/RC) fluxo específico de absorção por centro de reação ativo; (TRO/RC) fluxo específico de captura por centro de reação ativo; (ETO/RC) fluxo específico de transporte de elétrons por centro de reação ativo; (DIO/RC) Fluxo específico de dissipação por centro de reação ativo e (PIABS) índice de performance relativo a absorção. Médias seguidas pela mesma letra na linha entre ambientes, não diferem entre si a 5% de probabilidade, pelo teste de Tukey. O alagamento do substrato induziu uma redução nos teores fotossintéticos, porém não foram encontradas interações entre os genótipos e o ambiente para nenhum tipo de pigmento, logo as diferenças foram analisadas separadamente entre genótipos e entre ambientes como mostrado na tabela 5. Comparando os teores de clorofila a, b, totais e verificou-se que o Esfip-02 apresentou maiores valores mesmo os genótipos sendo estatisticamente iguais. Quando observamos os valores da razão de clorofila a/b o genótipo que apresentou o maior valor foi o SJ-02, porém não existem diferenças entre os genótipos (tabela 5). Quando analisamos os teores de carotenoides encontramos diferenças entre os genótipos estudados, onde o Esfip-02 apresentou maior valor e o SJ- Parâmetros NA AL NA AL Fo 629,5 a 907,95 b 638,625 b 1027,275 a Fm 3058,3 a 2815,2 b 3207 a 2572,625 b Fv 2428,8 a 1907,25 b 2568,375 a 1545,35 b VJ 0,60075 b 0,68725 a 0,53375 b 0,737 a φ Po 0,7445 a 0,616 b 0,76175 a 0,52675 b φ Eo 0,3025 a 0,2 b 0,35825 a 0,147 b φ Do 0,2555 b 0,384 a 0,2385 b 0,47325 a ABS/RC 2,44625 b 3,90075 a 2,289 b 5,7895 a TRO/RC 1,798 b 2,2325 a 1,6745 b 2,47775 a ETO/RC 0,70375 a 0,67375 a 0,772 a 0,62825 b DIO/RC 0,648 b 1,66825 a 0,61475 b 3,31225 a PIABS 9,94475 a 3,54375 b 15,39275 a 1,60225 b Tratamento 55 dias alagado19 dias alagado Tratamento 15 02 apresentou o menor valor dentre os cinco materiais avaliados (tabela 5). Embora não tenha havido interação significativa entre genótipos e ambiente, os teores de pigmentos foram reduzidos significativamente no ambiente com hipóxia (tabela 5). Tabela 5: Conteúdo de clorofila a, b e total (μg.ml-1), razão de clorofila a/b e carotenoides (μg.ml-1) de cinco genótipos de cacau cultivados em dois regimes hídricos (não alagado e alagado). Médias seguidas pela mesma letra na linha, entre genótipos e entre ambientes, não diferem entre si a 5% de probabilidade, pelo teste de Tukey. Discussão Todos os genótipos estudados apresentaram o aparecimento das bandas positivas durante os dias 19 e 55 após o alagamento. Quando submetidas a períodos longos de inundação ocorrem restrições, quando não são limitações estomáticas pode ser degradação de pigmentos (Kreuzwieser e Rennenberg, 2014). Segundo Yusuf et al. (2010) quando ocorre o aparecimento de banda K positiva significa que está ocorrendo uma inativação do complexo de evolução do oxigênio, com isso é possível perceber que o efeito do alagamento foi prejudicial as plantas já com 19 dias após submissão do estresse e foi se agravando a medida que a planta ficou mais tempo alagada. A fluorescência nos pontos O-J é dependente de luz e mostra informações sobre as reações de oxirredução da quinona A (Stirbet e Govindjee, 2011), quando ocorre à presença de bandas positivas durante este intervalo significa que o processo fotoquímico inicial foi comprometido pelo alagamento. Quando as plantas apresentam bandas L positivas, significa que está ocorrendo uma menor conectividade energética entre as unidades do FSII (Chen et al., 2016) devido distúrbios nas membranas dos tilacóides, logo quando apresenta uma conectividade menor, a energia de excitação não é utilizada de forma adequada, gerando uma instabilidade no sistema (Strasser Esfip-02 Cepec-2002 SJ-02 Pará TSH-1188 Não alagado Alagado Chl a 8,50375 a 8,29125 a 7,97 a 7,93125 a 6,73875 a 9,339 a 6,435 b Chl b 9,97625 a 9,8025 a 8,78625 a 8,785 a 7,92 a 10,418 a 7,69 b Chl a/b 0,86125 a 0,8425 a 0,9325 a 0,91375 a 0,87125 a 0,914 a 0,8545 b Chl totais 18,47375 a 18,085 a 16,75125 a 16,7125 a 14,65625 a 19,75 a 14,1215 b Carotenóides 650,4725 a 585,7825 ab 474,0325 b 491,58 b 525,865 ab 590,7555 a 500,3375 b AmbienteGenótipo Pigmentos 16 et al., 2004). O genótipo SJ-02 foi o único que conseguiu reduzir a Banda L aos 55 dias alagado e manter sua Banda K com valores abaixo de 0,8, indicando uma capacidade de recuperar o equilíbrio entre os elétrons no lado aceitador e doador no PSII (Martins et al., 2015). Com isso pode-se inferir que o alagamento aos 19 dias gerou uma menor conectividade das unidades do fotossistema II em todos os genótipos, que se agravou aos 55 dias após o alagamento. Os genótipos avaliados durante os 19 e 55 dias após o alagamento não apresentaram diferenças significativas, porém exibiram alterações negativas entre os ambientes controle e alagado. Valores aumentados para Fo e reduzidos de Fm também foram encontrados por diversos autores avaliando genótipos de cacau alagado (Bertolde et al., 2010; Bertolde et al., 2009; Silva Branco et al., 2017; Almeida, Tezara e Herrera, 2016). A fluorescência inicial (Fo) ocorre quando QA esta oxidada e os centros de reação estão abertos (Baker e Rosenqvst, 2004), quando ocorre um aumento em Fo é um indicativo que as plantas estão sob estresse devido uma diminuição do fluxo de elétrons pelo FSII (Oliveira et al., 2002), gerando danos à proteína D1 (Dias e Marenco, 2006) indicando limitações não estomáticas da fotossíntese, e pode ser um indicio de dano oxidativo (Baker, 2008). O declínio de Fm prejudica a redução dos aceptores de elétrons, prejudicando a captura de energia, podendo ser um mecanismo fotoprotetor pela dissipação de energia na forma de calor (Demmig-Adams e Adams,1992 ). A fluorescência variável (Fv) mede o fluxo de elétrons até a plastoquinona (Oukarroum et al., 2009), como mostrado na Tabela 4, houve uma redução da fluorescência variável (Fv) no ambiente alagado, essa redução pode ter ocorrido devido problemas na quebra da água e no transporte de elétrons. Os dados apresentados neste trabalho também apresentam reduções no fluxo do transporte de elétrons (ETO/RC) no alagamento. Essa redução pode ter ocorrido devido diminuição no pool de QA ativas, ocasionando aumento do DIO/RC (Shamshiri, Fattahi, 2016). Outro parâmetro que apresentou alteração foi a fluorescência variável no ponto J que sofreu um aumento pelo estresse de alagamento (tabela 4), o seu aumento pode ser ligado a capacidade de reoxidação das plastoquinonas, ocasionando uma desaceleração nessa reoxidação (Shamshiri, Fattahi, 2016). De acordo com os dados (tabela 4) 17 houve um aumento significativo de DIO/RC durante os 55 dias alagado, esse aumento associado à redução de φPo esta relacionado à fotoinibição nas plantas sob estresse, já que o φPo reduz quando o FSII é prejudicado (Martins et al., 2015 ; Hazratia et al., 2016; Souza et al., 2004). Os valores de φPo para plantas em condições ideias de cultivo variam de 0,75 a 0,85, quando ocorrem reduções no rendimento quântico máximo da fotoquímica primária (φPo) é um indicativo de menor capacidade de reduzir QA, indicando danos no FSII durante o estresse (Panda et al., 2006; Lin et al., 2009), estes valores ideais não foram observados quando os plantas estavam sob estresse de alagamento, já que apresentaram reduções aos 19 e 55 dias (tabela 4), Bertolde et al., (2012) encontrou resultados semelhantes em clones de cacau suscetíveis ao alagamento interpretando como evidência de limitação não-estomática da fotossíntese. Assim este parâmetro é considerado importante para constatar impactos na fotossíntese de plantas (Maxwell e Johnson, 2000). O aumento de ABS/RC pode ter causado inativação dos RCs, indicando fotoinibição (Tsimillimichael & Strasser, 2008). Smit et al. (2009) sugere que o aumento em ABS/RC esta relacionado com o aumento no sistema antena, como uma estratégia para melhorar a absorção de energia, em resposta ao aumento na absorção e na captura houve um aumento de DIO/RC que representa perda de energia por meio de calor, fluorescência ou pela transferência da energia para outros sistemas (Strasser et al., 2000). Com o aumento na dissipação da energia houve uma redução do rendimento quântico de transporte de elétrons (φEO) reduzindo a eficiência de deslocamento de fótons para o intersistema. O aumento de φDO assim como o aumento de DIO/RC durante o alagamento aos 19 e 55 dias só reforça que a planta dissipou mais energia na forma de calor como forma de proteção. Os parâmetros de rendimento quântico são utilizados como indicadores de estresse abiótico, visto que refletem a menor eficiência da utilização e dissipação da energia de excitação pela membrana fotossintética (Dabrowski et al., 2019). Durante os 19 dias alagado as plantas apresentaram redução nos valores de PIABS, esses valores apresentaram uma redução ainda maior quando avaliados durantes 55 dias alagado (tabela 4). O PIABS é um parâmetro que mede a captura de energia e reflete o transporte dos elétrons no FSII (Zhang et al., 2018), relacionando a densidade dos centros de reações e a 18 probabilidade da energia ir além da QA (Gonçalves et al., 2007), fornecendo informações sobre o sistema fotossintético das plantas. A redução neste parâmetro demonstra perda na capacidade de realizar reações fotoquímicas, e quando associado a outros parâmetros pode-se inferir que as plantas sob o estresse de alagamento foram menos eficientes na captura e no transporte de energia no FSII quando comparadas as plantas no ambiente não alagado. Um dos parâmetros utilizados para medir a capacidade fotossintética das plantas em condições de estresse é a presença de clorofila e carotenoides, em função da sua ligação durante a absorção e transferência de energia luminosa para o FSII (Nogueira et al., 2013), e por serem essenciais para o desenvolvimento das plantas (Nascimento et al., 2009). O alagamento do substrato influenciou negativamente os pigmentos, causando a redução dos pigmentos fotossintéticos na planta sob o alagamento reduzindo a capacidade de absorção de luz, isso por que o excesso de água reduz a concentração de oxigênio além de limitar a presença de nitrogênio e magnésio nas raízes causando danos aos pigmentos (Zaidi et al., 2007; Ronchi et al., 2006; Taiz & Zeiger 2009). Redução da clorofila se deve ao aumento da enzima clorofilase que degrada suas moléculas, devido o estresse inibir a molécula precursora da clorofila o ácido 5-aminolevulínico (Taiz & Zeiger, 2013; Freire et al., 2013). A clorofila b é a responsável pela captura da luz pela transferência para a clorofila a e assim participar das reações fotoquímicas (Freire et al., 2013) com a redução dessa clorofila no ambiente alagado, pode-se dizer que houve uma redução na captura da luz. Reduções nos teores da clorofila favorecem aparecimento de espécies reativa de oxigênio que vão oxidar os pigmentos (Carvalho et al. 2003), além da clorofilas a e b a redução da razão a/b durante o alagamento é um sinal de desajuste no funcionamento da fase fotoquímica (Taiz & Zeiger, 2009). Outro pigmento analisado durante estresse é o carotenoide, que é responsável por proteção contra fotodegradação dos fotossistemas contra fotooxidação (Mitler, 2002; Streit et al., 2005; LIMA et al., 2004). Como observado na tabela 5, longos períodos de alagamento ocorre a degradação dos pigmentos, gerando assim declínios fotossintéticos (Pezeshki, 2001). 19 Conclusão Não houve diferença entre os cinco genótipos estudados para os parâmetros avaliados durante os 19 e 55 dias de alagamento. O aparecimento das Bandas K e L são essenciais para a detecção de possíveis danos nas plantas sob o estresse, que foi confirmado a partir da interpretação dos parâmetros JIP. Redução no PIABS durante o estresse confirma que o alagamento causou danos no aparato fotossintético das plantas com 19 dias, piorando aos 55 dias alagado. Os genótipos não apresentaram diferenças significativas em relação aos teores de clorofila, para os carotenoides o genótipo Esfip-02 foi o que aumento. Quando comparados entre ambientes o alagado apresentou reduções nos pigmentos fotossintéticos quando comparado ao não alagado. Após o período do alagamento pode-se concluir que, para os parâmetros avaliados não foi possível detectar qual o genótipo mais resistente, apesar de não ter sido possível detectar diferença estatística entre os genótipos, o alagamento causou danos ao aparato fotossintético das plantas e reduções nos teores de pigmentos. 20 Referência de ALMEIDA, J.; TEZARA, W.; HERRERA, A. Physiological responses to drought and experimental water deficit and waterlogging of four clones of cacao (Theobroma cacao L.) selected for cultivation in Venezuela. Agricultural Water Management, v. 171, p. 80-88, 2016. ARAÚJO, C. P. de; AMORIM, E. V.; SOUZA, V. L., BERTOLDE; F. Z., DOS SANTOS, I. C.; MANGABEIRA, P. A. O. Toxicidade de chumbo e alagamento do solo: mecanismos de sobrevivência utilizados pelas plantas. Pindorama, v. 9, n. 9, p. 21-21, 2019. ARNON, D. I. Copper enzymes in isolates choroplasts. Polyphenoloxidade in Beta vulgaris. Plant Physiology, California, v. 24, n. 1, p. 1-15, 1949. BAKER, N. 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