FERNANDA BONINI DOS REIS IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES ACUMULADORAS DE ALUMÍNIO EM FORMAÇÃO FLORESTAL INUNDÁVEL DA RESTINGA: ANÁLISE QUÍMICA, HISTOQUÍMICA E ANATÔMICA VITÓRIA - ES 2021 UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO CENTRO DE CIÊNCIAS HUMANAS E NATURAIS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA VEGETAL FERNANDA BONINI DOS REIS IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES ACUMULADORAS DE ALUMÍNIO EM FORMAÇÃO FLORESTAL INUNDÁVEL DA RESTINGA: ANÁLISE QUÍMICA, HISTOQUÍMICA E ANATÔMICA Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Vegetal do Centro de Ciências Humanas e Naturais da Universidade Federal do Espírito Santo como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre/Doutor em Biologia Vegetal. Área de concentração: Fisiologia Vegetal. Orientadora: Prof.ª Dr.ª Camilla Rozindo Dias Milanez Coorientadora: Prof.ª Drª. Hiulana Pereira Arrivabene VITÓRIA - ES 2021 [PÁGINA DA FICHA CATALOGRÁFICA] IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES ACUMULADORAS DE ALUMÍNIO EM FORMAÇÃO FLORESTAL INUNDÁVEL DA RESTINGA: ANÁLISE QUÍMICA, HISTOQUÍMICA E ANATÔMICA FERNANDA BONINI DOS REIS Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Vegetal do Centro de Ciências Humanas e Naturais da Universidade Federal do Espírito Santo como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Biologia Vegetal na área de concentração Fisiologia Vegetal. Aprovada em 28 de setembro de 2021. Comissão Examinadora: ___________________________________ Drª. Camilla Rozindo Dias Milanez - UFES Orientadora e Presidente da Comissão ___________________________________ Drª. Silvia Tamie Matsumoto - UFES Examinador Interno _________________________________ Dr. Leonardo Valandro Zanetti Examinador Externo DEDICATÓRIA À minha mãe Ana Luíza Bonini, pelo amor, cuidado e apoio de sempre. Obrigada por ser o maior exemplo de força e determinação na minha vida. Dedico também ao meu pai Vitorino Silva (in memorian), tenho certeza que se estivesse presente se orgulharia de mim. AGRADECIMENTOS À Universidade Federal do Espírito Santo - UFES, em especial, ao Programa de Pós Graduação em Biologia Vegetal (PPGBV) pela infraestrutura e apoio concedido. À Fundação de Amparo à Pesquisa e Inovação do Espírito Santo - FAPES, pela concessão da bolsa de pesquisa através do Edital nº016/2018. À orientadora Profa. Dra. Camilla Rozindo Dias Milanez, por confiar em mim, pela paciência e dedicação durante esses dois anos e meio. Obrigada pelos ensinamentos e por querer sempre o melhor dos seus alunos. Obrigada por estar presente em momentos difíceis e ser tão bondosa. À coorientadora Profa. Dra. Hiulana Pereira Arrivabene, pela dedicação, incentivo e colaboração. Obrigada por sempre ser afetuosa. À Profa. Dra. Maria Tereza Carneiro, por disponibilizar o laboratório de Espectrometria Atômica- LabPetro, UFES. Agradeço também aos queridos doutorandos Rafael e Ana Kelly por colaborarem na execução das análises, pelo auxílio e disponibilidade de vocês, foram valiosos. Ao Prof. Dr. Gustavo Habermann- UNESP pela boa vontade e prontidão que teve em responder meus e-mails. Ao Dr. Jehová Lourenço Júnior pela importante colaboração. Aos amigos Felipe, Fabiano, Ricardo e João Pedro, pela imensa ajuda nos exaustivos dias de campo. Obrigada pela colaboração e amizade. A todos os demais colegas do Laboratório de Anatomia Vegetal pela boa convivência e trocas de experiências. Agradeço em especial à Erika. As queridas amigas, Lorrayne, Ariel, Camila, Natália, Gabriela, Elizabete, Fernanda Rodrigues, Fernanda Maria, Paula Roberta pelas conversas e companhias nos momentos felizes e também nos mais tristes. Obrigada por desfrutarem da vida comigo. Ao Roberto, pela atenção e ajuda. Estendo os agradecimentos aos integrantes da banca avaliadora, pela disponibilidade e comprometimento com a avaliação deste trabalho. À Deus pelo dom da vida e pelas oportunidades lançadas! RESUMO A acidez dos solos, compostos principalmente por minerais aluminossilicatos é uma condição natural em regiões tropicais. Solos com pH a 5.0 são favoráveis para a disponibilidade do Al3+, forma fitotóxica para algumas espécies. Altas concentrações de Al3+ são encontradas na Floresta Inundável, fitofisionomia de restinga pertencente à floresta tropical Atlântica. Algumas espécies vegetais adaptadas a solos ácidos desenvolvem mecanismos de exclusão ou de tolerância ao alumínio (acumuladoras). Desta forma, este trabalho teve como objetivo investigar se espécies lenhosas ocorrentes na Floresta Inundável de restinga do Parque Estadual Paulo César Vinha, Guarapari - ES são acumuladoras de alumínio; quantificar e verificar os principais sítios de acúmulo desse elemento e descrever a anatomia foliar e caulinar das espécies acumuladoras. Para tanto, as espécies acumuladoras foram identificadas por meio da quantificação do teor de Al em folhas e caule de 28 espécies reunidas em 24 famílias. Para a histolocalização do Al, secções transversais de folhas (limbo e pecíolo) e caules (estrutura primária e secundária) de material fresco foram submetidas ao teste com cromo azurol- S. A caracterização anatômica e histoquímica das espécies acumuladoras foi realizada de acordo com técnicas usuais de anatomia vegetal. As análises químicas revelaram que o maior acúmulo de alumínio ocorreu preferencialmente nas folhas em relação aos caules. Dentre as espécies avaliadas, Miconia sp.1, Miconia sp.2 e Laplacea fruticosa foram identificadas como acumuladoras de Al. Embora Pouteria cuspidata não tenha mostrado teor de Al acima de 1000 mg/kg-¹ de massa seca foliar, essa espécie mostrou alto teor de Al no látex (4991 mg/kg-¹), por isso incluímos essa espécie às demais acumuladoras. A análise histoquímica mostrou que o Al foi encontrado predominantemente impregnando paredes celulares, podendo também se acumular no lume celular. A presença de Al em células lignificadas não foi muito comum, mas em P. cuspidata e Miconia sp.1 foi observado o acúmulo em elementos de vaso em processo de diferenciação e na parede mais interna de fibras gelatinosas, respectivamente. Conclui-se que as quatro espécies lenhosas acumuladoras de Al não seguem um padrão de compartimentalização em folhas e caules, nem mesmo para as espécies do mesmo gênero. Já em Miconia, o alumínio ocorre nos mesmos sítios de acúmulo de compostos fenólicos, e merecem novos estudos a fim de compreender a relação entre esses dois elementos. Palavras-chave: Al³+ • floresta • Melastomataceae • Sapotaceae • Theaceae ABSTRACT The acidity of soils, composed mainly of aluminosilicate minerals is a natural condition in tropical regions. Soils with a pH value to 5.0 greatly affect Al3+ availability, a phytotoxic form for some species. High concentrations of Al3+ are found in the Floodable Forest, a restinga´s phytophysiognomy type to belonging to the Atlantic tropical forest. Some plant species adapted to acidic soils develop aluminum exclusion or tolerance mechanisms (accumulators). This study aimed to investigate whether woody species occurring in the restinga Floodable Forest of the Paulo César Vinha State Park, Guarapari - ES are aluminum accumulators; quantify and verify the main sites of storage of this element and describe the leaf and stem anatomy of the accumulating species. For this purpose, the accumulating species were identified through quantification of Al content in leaves and stems of 28 species belonging to 24 families. For the histolocalization of Al, cross sections of leaves (limb and petiole) and stems (primary and secondary structure) of fresh material were tested with chrome azurol S. The anatomical and histochemical characterization of the accumulating species was performed according to techniques of plant anatomy. The chemical analyzes revealed that the greatest aluminum accumulation occurred preferentially in the leaves in relation to the stems. Among the species evaluated, Miconia sp.1, Miconia sp.2 and Laplacea fruticosa were identified as Al accumulators. Although Pouteria cuspidata did not show Al content up to 1000 mg/kg-¹ of leaf dry mass, this species showed high content of Al in latex (4991 mg/kg-¹), that's why we included this species in the other accumulators. Histochemical analysis showed that Al was found predominantly impregnating cell walls, and may also accumulate in the content of some cells. The presence of Al in lignified cells was not very common, but in P. cuspidata and Miconia sp.1 was observed occurred accumulation in vessel elements in the process of differentiation and in the inner wall of gelatinous fibers, respectively. It is concluded that the four Al-accumulating woody species do not follow a pattern of compartmentalization in leaves and stems, not even for species of the same genus. In Miconia, aluminum occurs in the same sites of accumulation of phenolic compounds, and deserves further studies in order to understand the relationship between these two elements. Key words: Al³+ • forest • Melastomataceae • Sapotaceae • Theaceae LISTA DE FIGURAS Figura 1: Mapa político do Espírito Santo. (a) Destaque para o município de Guarapari, a Área de Proteção Ambiental de Setiba (APA de Setiba), e o Parque Estadual Paulo César Vinha - PEPCV. (b) Limites e localização da área de Floresta Inundável (adaptado de Cepemar, 2007; Google Earth Pro). ................... 233 Figura 2: Identificação de alumínio com cromo azurol- S em caules de espécies lenhosas da Floresta Inundável de restinga do Parque Estadual Paulo César Vinha, PEPCV – ES. (a) Laplacea fruticosa. (b) Miconia sp.1. (c) Miconia sp.2. (d) Pouteria cuspidata. (e) Látex natural de Pouteria cuspidata. (f) Látex de Pouteria cuspidata com cromo azurol- S ................................................................................. 29 Figura 3: Secções transversais em folhas e caules de Miconia sp.1 corados com cromo azurol - S. a-c Pecíolo. d- Nervura central. e- Área internervural. f- Caule em estrutura primária. g-h Caule em estrutura secundária. Córtex (co), epiderme (ep) fibras gelatinosas (fg), floema (fl), medula (me), parênquima paliçádico (pp), parênquima esponjoso (pe), raio parenquimático (rp), xilema (xi). Escala: g = 4 μm; a, e, f = 10 μm; b, c, d, h = 40 μm. ................................................................... 311 Figura 4: Secções transversais em folhas e caules de Miconia sp.2 corados com cromo azurol - S. a- Pecíolo. b- Nervura central. c- Área internervural. d-g Caule em estrutura primária. h- Caule em estrutura secundária. Córtex (co), epiderme (ep), floema (fl), medula (me); parênquima paliçádico (pp), parênquima esponjoso (pe), xilema (xi). Escala: a, b, c, d, h = 10 μm; e, f, g = 40 μm. ............................... 322 Figura 5: Secções transversais em folhas e caules de Laplacea fruticosa corados com cromo azurol - S. a- Pecíolo. b- Nervura central. c- Área internervural. d- Caule em estrutura secundária. Córtex (co), epiderme (ep), floema (fl), hipoderme (hp), parênquima paliçádico (pp), parênquima esponjoso (pe), xilema (xi). Escala: a, b, c, d = 10 μm. ................................................................................................... 333 Figura 6: Secções transversais em folhas de Pouteria cuspidata corados com cromo azurol – S. a- b Pecíolo. Córtex (co), xilema (xi). Escala: a = 40 μm; b = 10 μm ........................................................................................................................... 333 Figura 7: Secções transversais da folha de Miconia sp.1 coradas com safrablau. a. Pecíolo. b. Nervura central. c. Área internervural. d. Bordo. Bainha do feixe (bx), https://capgemini-my.sharepoint.com/personal/roberto_b_junior_capgemini_com1/Documents/Documents/Fernanda%20Bonini/Dissertação%20de%20mestrado-Fernanda%20Bonini%20dos%20Reis%2005092021.docx#_Toc81791341 https://capgemini-my.sharepoint.com/personal/roberto_b_junior_capgemini_com1/Documents/Documents/Fernanda%20Bonini/Dissertação%20de%20mestrado-Fernanda%20Bonini%20dos%20Reis%2005092021.docx#_Toc81791341 https://capgemini-my.sharepoint.com/personal/roberto_b_junior_capgemini_com1/Documents/Documents/Fernanda%20Bonini/Dissertação%20de%20mestrado-Fernanda%20Bonini%20dos%20Reis%2005092021.docx#_Toc81791341 colênquima (co), cutícula (ct), epiderme (ep), célula esclerificada (es), feixe vascular (fv), parênquima paliçádico (pp), parênquima esponjoso (pe), xilema (xi). As setas indicam drusas. Escala: a = 10 μm; b, c, d = 40 μm. .................................. 41 Figura 8: Secções transversais do caule de Miconia sp.1 coradas com safrablau. a-b. Caule em estrutura primária. c-d. Caule em estrutura secundária. Córtex (co), epiderme (ep), feixe vascular medular (fv), fibra gelatinosa (fg), floema (fl), medula (me), xilema (xi). As setas indicam drusas. Escala: c = 4 μm; a = 10 μm; b, d = 40 μm. .......................................................................................................................... 422 Figura 9: Testes histoquímicos em secções transversais da folha de Miconia sp.1. a-c. Pecíolo. d-e. Nervura central. f-h. Área internervural. Reações ao floroglucinol acidificado (a), cloreto férrico (b,d, f), lugol (c, e, g) e sudan (h). Célula esclerificada (es), colênquima (co), epiderme (ep), parênquima paliçádico (pp), parênquima esponjoso (pe). Escala: a, b, c, d, e = 10 μm; f, g, h = 40 μm. ............ 433 Figura 10: Testes histoquímicos em secções transversais do caule de Miconia sp.1. a-d. Caule em estrutura primária. e-h. Caule em estrutura secundária. Reações ao floroglucinol acidificado (a), cloreto férrico (b,e), lugol (c, f) e sudan (d, g, h). Célula esclerificada (es), córtex (co), epiderme (ep), feixe vascular medular (fv), floema (fl), medula (me), raio parenquimático (rp), súber (su), xilema (xi). As setas indicam gotas de óleo. Escala: e, f = 10 μm; a, b, c, d, g, h = 40 μm. ..................................................................................................................... 444 Figura 11: Secções transversais da folha de Miconia sp.2 coradas com safrablau. a. Pecíolo. b. Nervura central. c. Área internervural. d. Bordo. Bainha do feixe (bx), célula esclerificada (es), colênquima (co), cutícula (ct), epiderme (ep), feixe vascular (fv), floema (fl), hipoderme (hp), parênquima paliçádico (pp), parênquima esponjoso (pe), xilema (xi). As setas indicam drusas. Escala: a, b = 10 μm; c, d = 40 μm. ..................................................................................................................... 455 Figura 12: Secções transversais do caule de Miconia sp.2 coradas com safrablau. a-b. Caule em estrutura primária. c-d. Caule em estrutura secundária. Célula esclerificada (es), córtex (co), epiderme (ep), feixe vascular medular (fv), floema (fl), lenticela (le), medula (me), periderme (pe), tricoma (tr), xilema (xi). As setas indicam drusas. a = 4 μm; c, d = 10 μm; b = 40 μm. ............................................... 455 Figura 13: Testes histoquímicos em secções transversais da folha de Miconia sp.2. a-c. Pecíolo. d-g. Nervura central. h-j. Área internervural. Reações ao cloreto férrico (a, e, h), lugol (c, f, i), sudan (b, g, j) e floroglucinol acidificado (d). Colênquima (co), epiderme (ep), hipoderme (hp), parênquima paliçádico (pp), parênquima esponjoso (pe). Escala: a, b, c, d, e, f, g = 10 μm; h, i, j = 40 μm. ....... 466 Figura 14: Testes histoquímicos em secções transversais do caule de Miconia sp.2. a-d. Caule em estrutura primária. e-h. Caule em estrutura secundária. Reações ao floroglucinol acidificado (a, e), cloreto férrico (b, f), lugol (c, g) e sudan (d, h). Célula esclerificada (es), córtex (co), epiderme (ep), floema (fl), medula (me), raio parenquimático (rp), súber (su), xilema (xi). Escala: e, f, g, h = 10 μm; a, b, c, d = 40 μm. ................................................................................................... 477 Figura 15: Secções transversais da folha de Pouteria cuspidata coradas com safrablau. a. Pecíolo. b-d Nervura central. e. Área internervural. f. Bordo. Bainha do feixe (bx), canal laticífero (cn), colênquima (co), cutícula (ct), epiderme (ep), floema (fl), fibras (fi), medula (me), parênquima paliçádico (pp), parênquima esponjoso (pe), xilema (xi). As setas indicam drusas. Escala: a, b = 4 μm; c, d, e, f = 40 μm. .................................................................................................................. 488 Figura 16: Secções transversais do caule de Pouteria cuspidata coradas com safrablau. a-c. Caule em estrutura primária. d- Caule em estrutura secundária. Célula esclerificada (es), córtex (co), felogênio (fe), floema (fl), medula (me), periderme (pe), raio parenquimático (rp), súber (su), xilema (xi). As setas indicam drusas. Escala: a = 4 μm; b = 10 μm; c, d = 40 μm. ................................................ 499 Figura 17: Testes histoquímicos em secções transversais da folha de Pouteria cuspidata. a-d. Pecíolo. e-g. Nervura central. h-j Área internervural. Reações ao floroglucinol acidificado (d), cloreto férrico (a, e, h), lugol (b, g, i) e sudan (c, f, j). Célula esclerificada (es), córtex (co), epiderme (ep), medula (me), parênquima paliçádico (pp), parênqima esponjoso (pe). Escala: a, c = 4 μm; b, d, e, f, g = 10 μm; h, i, j = 40 μm. ................................................................................................. 5050 Figura 18: Testes histoquímicos em secções transversais do caule de Pouteria cuspidata. a-c. Caule em estrutura primária. d-f. Caule em estrutura secundária. Reações ao floroglucinol acidificado (a, f), cloreto férrico (b), lugol (c, d) e sudan (e). Célula esclerificada (es), córtex (co), floema (fl), medula (me), periderme (pe), raio parenquimático (rp), xilema (xi). Escala: a, b, c, d, e, f = 10 μm. ...................... 511 Figura 19: Secções transversais da folha Laplacea fruticosa coradas com safrablau. a- Pecíolo. b. Nervura central. c- Área internervural. d. Bordo. Bainha do feixe (bx), célula esclerificada (es), colênquima (co), cutícula (ct), epiderme (ep), floema (fl), hipoderme (hp), parênquima paliçádico (pp), parênquima esponjoso (pe), xilema (xi). As setas indicam drusas. Escala: a, b = 10 μm; c, d = 40 μm. ..................................................................................................................... 522 Figura 20: Secções transversais do caule de Laplacea fruticosa coradas com safrablau. a. Caule em estrutura primária. b. Caule em estrutura secundária. Célula esclerificada (es), córtex (co), epiderme (ep), floema (fl), fibra gelatinosa (fg), medula (me), periderme (pe), raio parenquimático (rp), xilema (xi). Escala: a, b = 40 μm. ............................................................................................................... 522 Figura 21: Testes histoquímicos em secções transversais da folha de Laplacea fruticosa. a-c. Pecíolo. d. Nervura central. e-h. Área internervural. Reações ao floroglucinol acidificado (b, h), cloreto férrico (a, d, e), lugol (f), sudan (c, g). Célula esclerificada (es), epiderme (ep), floema (fl), hipoderme (hp), parênquima paliçádico (pp), parênquima esponjoso (pe). Escala: a, b, c, d = 10 μm; e, f, g, h = 40 μm. ..................................................................................................................... 533 Figura 22: Testes histoquímicos em secções transversais do caule de Laplacea fruticosa. a-c. Caule em estrutura primária. d-h. Caule em estrutura secundária. Reações ao floroglucinol acidificado (a, f, h), cloreto férrico (b), lugol (c, e, g), sudan (d). Célula esclerificada (es), córtex (co), floema (fl), medula (me), raio parenquimático (rp), súber (su), xilema (xi). Escala: a, b, c, d, e, f, g, h = 40 μm. ... 544 LISTA DE TABELAS Tabela 1: Concentração de Al em folhas e caules de espécies lenhosas da Floresta Inundável de restinga, localizada no Parque Estadual Paulo Cesar Vinha – ES. ....................................................................................................................... 277 Tabela 2: Concentração de alumínio no látex de espécies lenhosas da Floresta Inundável de restinga, localizada no Parque estadual Paulo Cesar Vinha – ES.Erro! Indicador não definido. Tabela 3: Histolocalização de alumínio em folhas de espécies lenhosas da Floresta Inundável de restinga do Parque Estadual Paulo César Vinha, PEPCV – ES. .......................................................................................................................... 344 Tabela 4: Histolocalização de alumínio em caules em estrutura primária de espécies lenhosas da Floresta Inundável de restinga do Parque Estadual Paulo César Vinha, PEPCV – ES. ..................................................................................... 355 Tabela 5: Histolocalização de alumínio em caules em estrutura secundária de espécies lenhosas da Floresta Inundável de restinga do Parque Estadual Paulo César Vinha, PEPCV – ES. ..................................................................................... 355 https://capgemini-my.sharepoint.com/personal/roberto_b_junior_capgemini_com1/Documents/Documents/Fernanda%20Bonini/Dissertação%20de%20mestrado-Fernanda%20Bonini%20dos%20Reis%2005092021.docx#_Toc81791364 https://capgemini-my.sharepoint.com/personal/roberto_b_junior_capgemini_com1/Documents/Documents/Fernanda%20Bonini/Dissertação%20de%20mestrado-Fernanda%20Bonini%20dos%20Reis%2005092021.docx#_Toc81791364 https://capgemini-my.sharepoint.com/personal/roberto_b_junior_capgemini_com1/Documents/Documents/Fernanda%20Bonini/Dissertação%20de%20mestrado-Fernanda%20Bonini%20dos%20Reis%2005092021.docx#_Toc81791365 https://capgemini-my.sharepoint.com/personal/roberto_b_junior_capgemini_com1/Documents/Documents/Fernanda%20Bonini/Dissertação%20de%20mestrado-Fernanda%20Bonini%20dos%20Reis%2005092021.docx#_Toc81791365 https://capgemini-my.sharepoint.com/personal/roberto_b_junior_capgemini_com1/Documents/Documents/Fernanda%20Bonini/Dissertação%20de%20mestrado-Fernanda%20Bonini%20dos%20Reis%2005092021.docx#_Toc81791365 https://capgemini-my.sharepoint.com/personal/roberto_b_junior_capgemini_com1/Documents/Documents/Fernanda%20Bonini/Dissertação%20de%20mestrado-Fernanda%20Bonini%20dos%20Reis%2005092021.docx#_Toc81791366 https://capgemini-my.sharepoint.com/personal/roberto_b_junior_capgemini_com1/Documents/Documents/Fernanda%20Bonini/Dissertação%20de%20mestrado-Fernanda%20Bonini%20dos%20Reis%2005092021.docx#_Toc81791366 https://capgemini-my.sharepoint.com/personal/roberto_b_junior_capgemini_com1/Documents/Documents/Fernanda%20Bonini/Dissertação%20de%20mestrado-Fernanda%20Bonini%20dos%20Reis%2005092021.docx#_Toc81791366 https://capgemini-my.sharepoint.com/personal/roberto_b_junior_capgemini_com1/Documents/Documents/Fernanda%20Bonini/Dissertação%20de%20mestrado-Fernanda%20Bonini%20dos%20Reis%2005092021.docx#_Toc81791367 https://capgemini-my.sharepoint.com/personal/roberto_b_junior_capgemini_com1/Documents/Documents/Fernanda%20Bonini/Dissertação%20de%20mestrado-Fernanda%20Bonini%20dos%20Reis%2005092021.docx#_Toc81791367 https://capgemini-my.sharepoint.com/personal/roberto_b_junior_capgemini_com1/Documents/Documents/Fernanda%20Bonini/Dissertação%20de%20mestrado-Fernanda%20Bonini%20dos%20Reis%2005092021.docx#_Toc81791367 SUMÁRIOS 1. INTRODUÇÃO ....................................................................................... 155 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................... 177 2.1 Disponibilidade de Al nos solos tropicais e toxicidade às plantas .........177 2.2 Mecanismos de resposta e sítios de acúmulo do Al .............................188 2.3 Famílias acumuladoras de Al ................................................................. 19 3. OBJETIVO GERAL ................................................................................ 211 4. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................. 211 5. MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................... 222 5.1 Área de estudo .....................................................................................222 5.2 Seleção e coleta das espécies .............................................................222 5.3 Identificação de potenciais espécies acumuladoras de alumínio..............24 5.4 Quantificação do alumínio na matéria seca ..........................................244 5.5 Estudo anatômico qualitativo ................................................................255 5.6 Detecção histoquímica de alumínio ......................................................265 5.7 Coleta e análise do alumínio no látex .................................................. 266 6. RESULTADOS ....................................................................................... 277 6.1 Quantificação do alumínio em folhas e caules ........................................ 27 6.2 Detecção dos sítios de acúmulo do alumínio .......................................... 28 6.3 Caracterização anatômica das folhas e caules ....................................... 35 6.3.1 Miconia sp.1 ....................................................................................... 35 6.3.2 Miconia sp.2 .....................................................................................377 6.3.3 Pouteria cuspidata ...........................................................................388 6.3.4 Laplacea fruticosa .............................................................................. 39 7. DISCUSSÃO...............................................................................................55 8. CONCLUSÕES ...................................................................................... 599 REFERÊNCIAS ....................................................................................... 60 15 1. INTRODUÇÃO O alumínio (Al) é o terceiro elemento mais abundante da crosta terrestre (Arunakumara et al., 2013). A maioria dos minerais primários e secundários das rochas formados pela ação do intemperismo são aluminossilicatos que, quando decompostos pela água carregada de gás carbônico, liberam o alumínio na forma trocável (Al3+) (Miguel et al., 2010). Sendo que o fator determinando para a distribuição e biodisponibilidade do Al no solo é o pH (Wendling, 2012). Em solos ácidos com pH 5,0 a forma predominante do alumínio é Al3+, que é tóxico para a maioria das plantas (Silva et al., 2012). Algumas espécies vegetais adaptadas aos solos ácidos desenvolveram mecanismos de exclusão ou de tolerância ao Al3+ (Schmitt et al., 2016a). O mecanismo de exclusão elimina ou não permite a absorção do Al³+ via sistema radicular. Alguns ácidos orgânicos como, malato, citrato e oxalato podem ser secretados na raiz e formar compostos estáveis com o Al na rizosfera (Ryan et al., 2011), alterando o pH da rizosfera (Kochian et al., 2004). Outras espécies apresentam mecanismo de tolerância, metabolizam ou quelam o alumínio que adentra o simplasto em complexos não tóxicos e imobilizam em sítios como vacúolo e parede celular (Brunner e Sperisen, 2013; Kochian et al., 2015). Ao imobilizar o Al em seus tecidos, algumas espécies tolerantes são consideradas acumuladoras, concentrando acima 1000 mg de Al por kg de folha seca (Chenery, 1948). As folhas, geralmente, são órgãos que acumulam mais Al quando comparadas aos caules (Xião, 2002; Chen, 2006; Olivares et al., 2010) e frequentemente isso ocorre em espécies de Melastomataceae, Rubiaceae, Theaceae e Vochysiaceae (Jansen et al., 2002b). Espécies acumuladoras de Al se estabelecem principalmente em regiões tropicais, pois são mais adaptadas aos solos ácidos (Jones e Ryan, 2016), e a maioria das espécies que acumulam alumínio são espécies lenhosas (Shen e Ma, 2001). Nesse contexto, a floresta tropical Atlântica é um grande complexo vegetacional da América do Sul, sendo constituída de ecossistemas terrestres, dentre eles as restingas (Rizzini, 1963). Por se tratar de um ecossistema geologicamente recente, as espécies que se estabelecem nas restingas são provenientes de outros ecossistemas ou biomas, tais como Cerrado, Caatinga e a própria Mata Atlântica (Araújo, 2000). 16 As restingas se destacam por ocupar grandes áreas litorâneas. As planícies arenosas da restinga constituem substrato para várias comunidades vegetais que estão associadas a essa geomorfologia e apresentam adaptações às condições físicas e ambientais a esse ambiente (Cordeiro, 2005). Uma das maiores áreas preservadas de restinga do Brasil é a restinga do Parque Estadual Paulo César Vinha - PEPCV, Guarapari- ES, que está inserida na Área de Proteção Ambiental de Setiba e constitui uma área prioritária para conservação da biodiversidade (MMA 2000; Kuster et al., 2019). Entre as diferentes fitofisionomias florestais que compõem a restinga do PEPCV, a Floresta Inundável se destaca por apresentar solo rico em matéria orgânica, proximidade do lençol freático, acidez elevada e altas concentrações de Al3+ (Reis-Duarte et al., 2002; Pereira, 2003; Rocha, 2012; Magnano et al., 2013). A influência do alumínio em culturas agrícolas é bem estudada (Kochian et al., 2004; Banhos et al., 2016; Long et al., 2017). Já em espécies nativas tropicais, há estudos sobre o acúmulo de alumínio, sobretudo em espécies do cerrado, mas pouco se sabe a respeito da ocorrência e dos mecanismos de tolerância de espécies acumuladoras de Al na restinga. O conhecimento de estratégias adaptativas de diferentes grupos vegetais é necessário para o entendimento da ecologia de comunidades de restinga e fornecer subsídios para um possível emprego dessas plantas na recuperação e no manejo de áreas degradadas. Considerando a disponibilidade de Al3+ na Floresta Inundável de restinga do PEPCV, Guarapari- ES, este trabalho busca investigar se espécies lenhosas são acumuladoras de alumínio e identificar os sítios de acúmulo desse elemento. 17 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Disponibilidade de Al nos solos tropicais e toxicidade às plantas Em solos, o pH é o fator determinante para a disponibilidade de alumínio trocável (Ronquim, 2010). Em condições ácidas com pH próximo a 5,0 há um aumento da solubilidade do Al3+ no solo, causando toxicidade para algumas plantas (Wendling, 2012) que, sob tais condições, podem afetar seu crescimento e desenvolvimento (Basso et al., 2003). O processo natural de acidificação dos solos é influenciado por diferentes fatores, tais como: remoção de cátions básicos devido às intempéries, liberação de nitrato e hidrogênio pela decomposição de matéria orgânica por microorganismos do solo (Bohnen, 1995) e ocorrência as chuvas ácidas (Brena, 2002). A acidez dos solos pode ser dividida em três componentes: a acidez ativa, que corresponde à atividade dos íons hidrogênio em solução, acidez trocável, que corresponde normalmente à quantidade de Al3+ adsorvido aos colóides do solo e acidez potencial, que corresponde à soma da acidez trocável com a não trocável (H+) (Ebeling et al., 2008). Os solos de restinga são predominantemente espodossolos e, em menores extensões, neossolos quartzarênicos (Coelho et al., 2010). Em espodossolos, são frequentemente encontradas quatro principais formas de alumínio, o Al trocável, complexos Al-húmus, Al substituindo o Fe nos óxidos de Fe livres e polímeros de Al-hidroxi (Dahlgren e Walker, 1993). Essas formas geralmente são formadas em condições de hidromorfismo (Van Breemen e Buurman, 2002). Há espécies de plantas acumuladoras que só ocorrem em áreas acidificadas na presença de Al, outras são restritas a solos calcários e, ainda, há espécies indiferentes a esses fatores (Ratter et al., 1977, 1978). Alguns pesquisadores propõem que esse elemento não apresenta toxicidade para algumas espécies e que algumas, inclusive, podem ser alumínio-dependentes, i.e, necessitam desse elemento para seu crescimento e desenvolvimento (Haridasan, 2008a; Silva, 2017), como é o caso de Rudgea viburnoides (Santana, 2017) e de Vochysia tucanorum (Bressan et al., 2021). Espécies lenhosas de Melastomataceae e Vochysiaceae, por exemplo, parecem depender da presença do alumínio em solos ácidos do Cerrado para a sua sobrevivência (Jansen et al., 2002b). Outras espécies, como Qualea grandiflora e Qualea parviflora 18 (Vochysiaceae) crescem e acumulam Al tanto em solos ácidos como em solos calcários com baixa saturação de Al (Nogueira et al., 2018). Sendo assim, o acúmulo de Al pode ser uma característica intrínseca das espécies, e não relacionado diretamente à disponibilidade do elemento no solo (George e Neumann, 2012). Portanto, toxicidade por Al não é um conceito universal que se aplica às nativas (Haridasan, 2008a; Haridassan, 2008b), de modo que a tolerância ao Al pode ser uma característica importante na avaliação das espécies quanto ao seu uso na restauração florestal (Ulrich et al., 1980). 2.2 Mecanismos de resposta e sítios de acúmulo do Al As espécies podem apresentar dois mecanismos de respostas ao Al: de exclusão, quando o Al é impedido de entrar no simplasto, e o mecanismo de tolerância, quando o Al é imobilizado e acumulado no simplasto das células de raízes e da parte aérea podendo ocorrer mecanismos internos de detoxificação (Kochian et al., 2015). Os mecanismos de resposta das espécies excludentes incluem processos de exsudação de ácidos orgânicos no ápice da raiz, formação de barreira de pH na rizosfera e efluxo de Al (Rampim e Lana, 2013), de forma a impedir a entrada desse elemento na planta. Os ácidos orgânicos mais comuns na tolerância ao Al são o citrato, malato e oxalato, que podem ser exsudados pelas raízes. Estes ácidos podem ser exsudados pelas raízes (Hartwig et al, 2007; Ryan et al., 2011). No mecanismo de tolerância, após a absorção, a planta pode redirecionar o Al para diferentes compartimentos das células da raiz e transloca-lo para a parte aérea, imobilizando-o em diferentes tecidos (Kochian et al., 2015). Além disto, a entrada do Al ativa mecanismos celulares de detoxificação, nos quais sua toxicidade é neutralizada através da formação de quelatos no citossol via ligantes orgânicos (Quintal et al., 2017). O Al é translocado para a parte aérea via xilema, em complexos Al-citrato e Al-malato (Kinraide et al., 2005), sendo fixado em diferentes compartimentos, como parede celular e vacúolos (Taylor, 1991). Segundo Bressan et al. (2016), o principal sítio de acúmulo de Al em espécies lenhosas do Cerrado é a parede celular primária. De fato, há evidências que o Al se liga fortemente a esse sítio (Brunner e Sperisen, 2013; Hajiboland e Poschenrieder, 2015), devido à alta afinidade com a pectina (Wehr et al., 2010; https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0098847202000138?casa_token=VjL7PRlUus0AAAAA%3AKRJ0uGO3C3eWU3hv3ighDoG2-Cp1dERorkaIK-6cAkphQzIkwyP2Ugjb5RpNyTjEI3HJxfnT95Mf&BIB119 19 Yang et al., 2011). O Al, ao se ligar com as cargas negativas das pectinas, forma um complexo estável permanecendo na parede celular até a senescência foliar (Hajiboland e Poschenrieder, 2015). Esse mecanismo impede que o Al entre em contato direto com estruturas ativas do metabolismo e com processos metabólicos (Grevenstuk e Romano, 2013). Entretanto, recentemente, foram evidenciadas organelas, como cloroplastos, atuando como sítios de acúmulo de Al e estuda-se as possíveis interferências do Al na atividade fotossintética e na estrutura celular (Malta et al., 2016; Santana, 2017). Cabe ressaltar que a maioria dos dados citados foram extraídos de estudos com cultivares, existindo poucas informações sobre plantas nativas. Observa-se que o acúmulo de Al em tecidos foliares ocorre em células com paredes não lignificadas (Bressan, 2016; Nogueira, 2018), como paredes celulares da epiderme (Rosa, 2018), no parênquima paliçádico, no parênquima esponjoso (Andrade et al., 2011; Silva, 2017), no colênquima (Junior, 2012) e no floema (Silva, 2017; Moreira, 2016). Em células do xilema e em células esclerificadas não é comum ocorrer acúmulo de Al (Nogueira, 2018), mas as paredes celulares mais internas de fibras gelatinosas podem ser sítios de acúmulo desse elemento (Milanez et al., 2009). 2.3 Famílias acumuladoras de Al Sabe-se que algumas plantas acumulam quantidades significativas de alumínio em seus tecidos (Jansen et al., 2002b), sendo a maioria espécies lenhosas (Shen e Ma, 2001). Em geral, plantas que acumulam mais de 1000 mg de Al por kg de massa seca foliar, são consideradas acumuladoras (Chenery, 1948). As espécies acumuladoras de Al pertencem principalmente às famílias Melastomataceae, Rubiaceae, Simplocaceae e Vochysiaceae. Além disso, são conhecidas outras 45 famílias de espécies acumuladoras, sendo algumas delas: Anisophyllaceae, Celastraceae, Cornaceae, Diapensaceae, Geissolomataceae, Grossulariaceae, Pentaphylaceae, Polygalaceae, Proteaceae, Symplocaceae e Theaceae (Jansen et al., 2002b). Melastomataceae inclui cerca de 4.500 espécies em aproximadamente 166 gêneros (Renner, 1993). Possui diversas espécies caracterizadas como tolerantes ou acumuladoras de alumínio, sendo a segunda família com maior número de espécies acumuladoras de alumínio em angiospermas, encontradas 20 frequentemente nos gêneros Clidemia, Leandra, Melastoma, Memecylon, Miconia, Mouriri e Tibouchina (Jansen et al., 2002a). Segundo Haridasan (2008b) e Teixeira (2013), essas espécies adquiriram essa característica ao longo dos anos por terem se estabelecido em solos do Cerrado que possuem elevadas concentrações de alumínio. Algumas espécies, como por exemplo, Miconia albicans, parecem não sobreviver à ausência de alumínio (Nogueira, 2018). Outras, na presença desse elemento podem melhorar o seu desenvolvimento, como é o caso de Melastoma malabathricum e Tibouchina granulosa (Watanabe et al., 2008; Freitas et al., 2017). A família Vochysiaceae abrange oito gêneros, dos quais seis ocorrem exclusivamente no continente americano, principalmente no Brasil, sendo eles: Callisthene, Erisma, Qualea, Ruizterania, Salvertia e Vochysia (Souza e Lorenzi, 2012). As espécies Vochysia thyrsoidea, Qualea grandiflora e Qualea parviflora são espécies lenhosas que crescem e acumulam alumínio no Cerrado independentemente do potencial hidrogeniônico do solo (Nogueira, 2018). No caso da Q. grandiflora, esta espécie possui o metabolismo alumínio-dependente (Silva, 2017). A espécie de chá, Camellia sinensis L., pertence à família Theaceae, tem sido muito estudada na tolerância ao alumínio (Moreira, 2016). Essa planta além de acumular altos teores de Al em suas folhas tem seu crescimento favorecido na presença de Al (Xu et al., 2016; Ding et al., 2021). Camellia oleifera também se destaca nos mecanismos de acúmulo de Al (Zeng et al., 2012). Algumas espécies dessa família acumulam alumínio preferencialmente nas folhas em desenvolvimento quando comparada com folhas em processo de senescência ou caules, como é o caso da Camellia japonica, C. sasanqua, C. sinensis, Stewartia monadelpha e Stewartia pseudocamellia (Osawa et al., 2013). A família Rubiaceae possui muitos representantes acumuladores de alumínio (Jansen et al., 2002b). No trabalho de Jansen et al. (2003), 10 das 11 espécies de Rubiaceae testadas eram acumuladoras de Al. A concentração mais alta encontradas para esse elemento foi relatada para Faramea insignis (40000 mg kg-¹) (Chenery, 1946). Outros membros de Rubiaceae que apresentam níveis de Al acima de 10000 mg kg-¹ ocorrem nas tribos Coussareeae, Craterispermeae, Lasiantheae, Pauridiantheae, Prismatomerideae, Psychotrieae e Urophylleae (Jansen et al., 2003). 21 3. OBJETIVO GERAL Identificar se há espécies lenhosas acumuladoras de alumínio na Floresta Inundável da restinga do Parque Estadual Paulo César Vinha, ES, e localizar histoquimicamente os sítios de acúmulo desse elemento em folha e caule. 4. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Identificar potenciais espécies acumuladoras de Al por meio de teste histoquímico específico; Quantificar o teor de alumínio em folhas e caules das espécies lenhosas da Floresta Inundável; Detectar histoquimicamente a presença de alumínio em folhas e caules; Verificar se paredes celulares e vacúolos constituem os principais sítios de acúmulo de alumínio nos tecidos foliares e caulinares das espécies acumuladoras; Caracterizar a anatomia das folhas e dos caules das espécies acumuladoras de alumínio. 22 5. MATERIAIS E MÉTODOS 5.1 Área de estudo O estudo foi realizado na Floresta Inundável da restinga do Parque Estadual Paulo César Vinha (PEPCV) (fig. 1). Essa fitofisionomia localiza-se em uma área de depressão de relevo entre cordões arenosos com solo do tipo organossolo (Magnago et al., 2013; Cepemar, 2007). A área selecionada na Floresta Inundável seguiu a demarcação feita por Lourenço et al. (2021), sendo formada por 14 parcelas de 5 x 25 m e uma área total de 1.750m². O solo das parcelas caracteriza-se por ser arenoso e os teores de matéria orgânica são variáveis entre as parcelas, mas considerados altos (>3 dag/kg). O pH dos solos é fortemente ácido com valores entre 3,6 e 4,9, e a concentração de Al3+ varia de 0,25 a 6,4 molc/dm³, considera- se alto >1 (Prezotti e Guarçoni, 2013). O PEPCV possui aproximadamente 1.500 ha e encontra-se localizado no município de Guarapari- ES, entre as coordenadas 20° 35'25'' S e 40° 25'24'' O. O clima da região é do tipo Aw tropical segundo classificação de Köppen e Geiger (1928), feita por (Alvares et al., 2013), apresentando verões quentes e chuvosos, e invernos frios e secos. A temperatura média anual da área é de 24,2 ºC e a precipitação média anual é de 1.275 mm (Cepemar, 2007). 5.2 Seleção e coleta das espécies As 28 espécies lenhosas selecionadas foram: Tapirira guianensis Aubl. (Anacardiaceae), Xylopia sericea A. St-Hil. (Annonaceae) Aspidosperma pyricollum Mull.Arg. (Apocynaceae), Schefflera selloi (Marchal) Frodin & Fiaschi (Araliaceae), Tabebuia cassinoides (Lam.) DC. (Bignoniaceae), Protium icicariba (DC.) Marchand (Burseraceae), Calophyllum brasiliense Cambess. (Calophyllaceae), Cynophalla flexuosa (L.) J.Presl (Capparaceae), Symphonia globulifera L.f. (Clusiaceae), Sloanea guianensis (Aubl.) Benth. (Elaeocarpaceae), Erythroxylum sp. (Erythroxylaceae), Alchornea triplinervia (Spreng.) Mull. Arg., Sapium glandulatum (Vell.) Pax. (Euphorbiaceae), Andira fraxinifolia Benth., Inga laurina (Sw.) Willd. (Fabaceae), Cryptocarya saligna Mez. (Lauraceae), Eriotheca pentaphylla (Vell. & K. Schum.) A. Robyns, Pseudobombax grandiflorum (Cav.) A. Robyns (Malvaceae), Miconia sp.1, Miconia sp.2 (Melastomataceae), Emmotum nitens (Benth.) Miers (Icacinaceae), Ficus sp. (Moraceae), Myrcia racemosa (O.Berg) Kiaersk. (Myrtaceae), Psychotria mapourioides DC. (Rubiaceae), 23 Pouteria cuspidata (A. DC.) Baehni. (Sapotaceae), Simarouba amara Aubl. (Simaroubaceae), Laplacea fruticosa (Schrad.) Kobuski (Theaceae), Cecropia pachystachya Trécul (Urticaceae). As espécies em estudo foram identificadas e marcadas com placas de alumínio por Lourenço et al. (2021), sendo as coletas realizadas em setembro de 2020. As espécies encontram-se no Herbário VIES. Algumas espécies serão depositadas assim que entrarem em fase reprodutiva (Tabela 1). Figura 1: Mapa político do Espírito Santo. (a) Destaque para o município de Guarapari, a Área de Proteção Ambiental de Setiba (APA de Setiba), e o Parque Estadual Paulo César Vinha - PEPCV. (b) Limites e localização da área de Floresta Inundável (FNI) (adaptado de Cepemar, 2007; Google Earth Pro). 24 5.3 Identificação de potenciais espécies acumuladoras de alumínio A identificação de potenciais espécies acumuladoras de alumínio foi feita em campo. Para tanto, foi utilizado o reagente cromo azurol – S em porções caulinares medindo aproximadamente 7 cm de diâmetro. O teste foi feito em um indivíduo por espécie e o tempo de reação do reagente foi de 30 min sendo considerado positivo à presença de alumínio quando a solução adquire coloração roxa. 5.4 Quantificação do alumínio na matéria seca Foi realizada a quantificação do teor de Al em folhas (aprox. 40 folhas por árvore) e caules (aprox. 20 cm de comprimento localizado a partir do segundo entrenó) de três indivíduos (n=3). As amostras foram lavadas em água corrente, água deionizada e secas com papel de filtro. Posteriormente, o material foi seco em estufa de ventilação forçada de ar a 60ºC até alcançar massa constante. Após secagem, as folhas e os caules foram pulverizados em moinho de bola (Tecnal TE-350, São Paulo, Brasil). Para a decomposição das amostras foi pesado 0,25 g de amostras de folhas e caules, em seguida, foram adicionados, 06 mL de água ultrapura tipo 1+, 1,5 mL peróxido de hidrogênio (H2O2) 30% v v-1 e 2,5 mL de ácido nítrico concentrado (HNO3). Em seguida, as misturas foram decompostas utilizando aquecimento por radiação micro-ondas (Multiwave GO, Anton Paar, Suíça). O programa de aquecimento utilizado consistiu em uma etapa de aquecimento onde a temperatura atingiu 180ºC em aproximadamente 5 min e permaneceu nesta temperatura por 15 min. Após o período de resfriamento, as amostras foram transferidas para tubos do tipo Falcon, avolumadas com água ultrapura para o volume final de 25,0 mL, e armazenadas em geladeira até a leitura no espectrômetro (GF AAS). Os brancos foram preparados utilizando o mesmo protocolo sem as amostras, i.e., somente os reagentes. A fim de verificar a eficiência do método analítico realizou-se a mesma decomposição utilizando material certificado de referência (MRC) NIST 1573ª (Folhas de tomate) (NIST, EUA). As recuperações dos CRMs foram na faixa de 90 a 100 % indicando boa exatidão no método. Para a determinação de Al por espectrometria de absorção atômica com atomização eletrotérmica em forno de grafite (GF AAS) foi utilizado o 25 espectrômetro modelo AAS ZEEnit 700 (Analytic Jena, Alemanha), com amostrador automático no modo forno. Como fonte de radiação, foi utilizada lâmpada de catodo oco (HCL, Analytik Jena, Alemanha), pertence ao Laboratório de Espectrometria Atômica (LEA), LabPetro-DQUI/UFES. A classificação das espécies em acumuladoras ou não acumuladoras de alumínio seguiu o critério proposto por Chenery (1948), sendo consideradas acumuladoras aquelas que apresentam pelo menos 1000 mg de Al por kg de massa seca foliar. 5.5 Estudo anatômico qualitativo Das espécies acumuladoras de alumínio, foram coletadas folhas e caules para o estudo anatômico qualitativo. Folhas totalmente expandidas (n=3) localizadas no 3º nó a partir do ápice do ramo foram fixadas em FAA 50 (Formaldeído 37%, ácido acético glacial, etanol 50%, na proporção 1:1:18) (Johansen, 1940) e estocadas em etanol 70%. Cortes transversais foram feitos à mão livre e submetidos à dupla coloração com safrablau (Kraus e Arduin, 1997). Para o estudo da anatomia dos caules (n=3), foram coletadas amostras em crescimento primário (1º entrenó a partir do ápice do ramo) e em crescimento secundário (3º entrenó a partir do ápice do ramo). Esse material foi fixado em FAA 50 (Johansen, 1940) e estocado em etanol 70%. Cortes transversais de caules em crescimento primário foram feitos à mão livre, enquanto cortes transversais de caules em crescimento secundário foram feitos com auxílio de micrótomo de deslize. As seções foram submetidas à dupla coloração com safrablau (Kraus e Arduin, 1997). O laminário obtido foi analisado com auxílio de microscópio de luz e os resultados documentados em fotomicroscópio Nikon (Eclipse 50i, Japão). Secções transversais obtidas de material vegetal fresco foram submetidas aos seguintes testes histoquímicos: solução de lugol para detecção de amido, sudan IV em etanol para detecção de substâncias lipídicas, solução de cloreto férrico para detecção de compostos fenólicos e solução de floroglucina ácida para detecção de lignina (Johansen, 1940). As lâminas foram preparadas utilizando glicerina pura como meio. A classificação dos tricomas foi identificada de acordo com Theobald et al. (1980). 26 5.6 Detecção histoquímica de alumínio Secções transversais de folhas e caules de material vegetal fresco em crescimento primário e secundário (n=3) foram submetidas ao teste histoquímico cromo azurol- S a 0,5% pH de 4,15 (0,5 g de cromo azurol- S, 5,0 g de acetato de sódio e 100 mL de água deionizada), seguindo as recomendações de Bressan et al. (2016). As secções foram analisadas com auxílio de microscopia de luz e os resultados foram documentados em fotomicroscópio Nikon (Eclipse 50i, Japão). 5.7 Coleta e análise do alumínio no látex Amostras de látex foram coletadas a partir de incisões na casca do caule principal das espécies: Ficus sp. e P. cuspidata. As amostras foram armazenadas a - 80ºC em ultrafreezer (MDF-U500VXC, Canadá, EUA). Foi utilizada uma massa de 0,25 g e o protocolo de decomposição e leitura do látex foi idêntico ao protocolo utilizado em folhas e caules. 27 6. RESULTADOS 6.1 Quantificação do alumínio em folhas e caules Das 28 espécies lenhosas, são acumuladoras de alumínio: Miconia sp.1, Miconia sp.2 e L. fruticosa, uma vez que ocorrem indivíduos com as concentrações acima de 1000 mg/kg-¹ de Al nas folhas (Tabela 1). P. cuspidata apresentou altas concentrações de Al no látex, por isso foi incluída às demais acumuladoras (Erro! Fonte de referência não encontrada.). As concentrações e Al foliar foram maiores que as concentrações de Al caulinar, com exceção de A. pyricollum, C. brasiliense e P. grandiflorum (Tabela 1). Tabela 1: Concentração de Al em folhas e caules de espécies lenhosas da Floresta Inundável de restinga, localizada no Parque Estadual Paulo Cesar Vinha – ES. Os valores representam média ± desvio padrão. 28 Tabela 2: Concentração de alumínio no látex de espécies lenhosas da Floresta Inundável de restinga, localizada no Parque Estadual Paulo Cesar Vinha – ES. Os valores representam média ± desvio padrão. 6.2 Detecção dos sítios de acúmulo do alumínio Dentre as 28 espécies lenhosas testadas em campo com o reagente cromo azurol- S, quatro apresentaram reação positiva ao teste: Miconia sp.1, Miconia sp.2, L. fruticosa e P. cuspidata (fig. 2). Em Miconia sp.1, o teste histoquímico detectou Al em todos os tecidos do pecíolo (fig. 3a) e da nervura central (fig. 3d). A reação foi observada principalmente na parede (fig. 3b), mas também no conteúdo de algumas células do parênquima e do colênquima (fig. 3c). Na área internervural, o Al foi encontrado no parênquima clorofiliano, especialmente no parênquima esponjoso (fig. 3e). Nos caules em crescimento primário, os sítios de acúmulo foram evidenciados no córtex, nos tecidos vasculares e na medula (fig. 3f). Quando em crescimento secundário, o caule mostrou acúmulo de Al no córtex, no floema primário e secundário (fig. 3g), em fibras gelatinosas, raios e células parenquimáticas axiais e radiais do xilema e na medula (fig. 3h). 29 Figura 2: Identificação de alumínio com cromo azurol- S em caules de espécies lenhosas da Floresta Inundável de restinga do Parque Estadual Paulo César Vinha, PEPCV – ES. (a) Laplacea fruticosa. (b) Miconia sp.1. (c) Miconia sp.2. (d) Pouteria cuspidata. (e) Látex natural de Pouteria cuspidata. (f) Látex de Pouteria cuspidata com cromo azurol- S Folhas de Miconia sp.2 mostraram reação positiva ao teste histoquímico na epiderme e no córtex do pecíolo (fig. 4a), no córtex e no floema da nervura central (fig. 4b) e em algumas células do parênquima esponjoso da região internervural (fig. 4c). O caule em crescimento primário mostrou acúmulo de Al no córtex (fig. 4g), no floema (fig. 4f) e na parede celular de algumas células do parênquima próximas aos feixes medulares e na porção mais externa da medula (fig. 4d, 4e). Já no caule em crescimento secundário, o Al foi observado apenas no floema secundário (fig. 4h). Folhas de L. fruticosa mostraram reação positiva ao teste na epiderme do pecíolo (fig. 5a), da região da nervura central (fig. 5b) e área internervural (fig. 5c). 30 O pecíolo ainda mostrou reação no córtex, floema e xilema (fig. 5a) e a área internervural também mostrou reação em células da hipoderme (fig. 5c). Caules em estrutura primária não mostraram sítio de acúmulo de Al, enquanto caules em estrutura secundária acumularam Al em fibras e raios parenquimáticos do xilema e em raios do floema (fig. 5d). Em P. cuspidata, o Al foi detectado nos canais laticíferos presentes no córtex e na medula de folhas e caules (fig. 6a). Também foi observado acúmulo de Al em vasos no xilema do pecíolo (fig. 6b). As informações sobre os sítios de acúmulo de Al nas quatro espécies encontram-se sumarizadas na Tabela 2, Tabela 3 e Tabela 4. 31 Figura 3: Secções transversais em folhas e caules de Miconia sp.1 corados com cromo azurol - S. a-c Pecíolo. d- Nervura central. e- Área internervural. f- Caule em estrutura primária. g-h Caule em estrutura secundária. Córtex (co), epiderme (ep) fibras gelatinosas (fg), floema (fl), medula (me), parênquima paliçádico (pp), parênquima esponjoso (pe), raio parenquimático (rp), xilema (xi). Escala: g = 4 μm; a, e, f = 10 μm; b, c, d, h = 40 μm. 32 Figura 4: Secções transversais em folhas e caules de Miconia sp.2 corados com cromo azurol - S. a- Pecíolo. b- Nervura central. c- Área internervural. d-g Caule em estrutura primária. h- Caule em estrutura secundária. Córtex (co), epiderme (ep), floema (fl), medula (me); parênquima paliçádico (pp), parênquima esponjoso (pe), xilema (xi). Escala: a, b, c, d, h = 10 μm; e, f, g = 40 μm. 33 Figura 5: Secções transversais em folhas e caules de Laplacea fruticosa corados com cromo azurol - S. a- Pecíolo. b- Nervura central. c- Área internervural. d- Caule em estrutura secundária. Córtex (co), epiderme (ep), floema (fl), hipoderme (hp), parênquima paliçádico (pp), parênquima esponjoso (pe), xilema (xi). Escala: a, b, c, d = 10 μm. Figura 6: Secções transversais em folhas de Pouteria cuspidata corados com cromo azurol – S. a- b Pecíolo. Córtex (co), xilema (xi). Escala: a = 40 μm; b = 10 μm 34 Tabela 2: Histolocalização de alumínio em folhas de espécies lenhosas da Floresta Inundável de restinga do Parque Estadual Paulo César Vinha, PEPCV – ES. 35 Tabela 3: Histolocalização de alumínio em caules em estrutura primária de espécies lenhosas da Floresta Inundável de restinga do Parque Estadual Paulo César Vinha, PEPCV – ES. Tabela 4: Histolocalização de alumínio em caules em estrutura secundária de espécies lenhosas da Floresta Inundável de restinga do Parque Estadual Paulo César Vinha, PEPCV – ES. 6.3 Caracterização anatômica das folhas e caules 6.3.1 Miconia sp.1 A folha de Miconia sp.1 apresenta pecíolo com contorno côncavo na face adaxial e convexo na face abaxial em secção transversal. A epiderme é unisseriada e, abaixo dela, células do colênquima compõem duas a cinco camadas por toda a circunferência do pecíolo (fig. 7a). Verifica-se o acúmulo de compostos fenólicos (fig. 9b) e amido (fig. 9c) em células colenquimáticas e parenquimáticas. Córtex e medula apresentam parênquima de preenchimento com numerosas drusas (fig. 7a) e esclereídes (fig. 9a). Os feixes vasculares são 36 de diferentes calibres e distribuem-se na forma de arco (fig. 7a). A nervura principal, em secção transversal, apresenta-se convexa em ambas as faces. Adjacente à epiderme observa-se três a seis camadas de colênquima lamelar na face adaxial e duas a cinco camadas de colênquima angular na face abaxial (fig. 7b). Células do colênquima e células do parênquima cortical mostraram acúmulo de compostos fenólicos (fig. 9d) e amido (fig. 9e). A região da medula é composta principalmente por parênquima de preenchimento. Idioblastos contendo drusas foram encontrados dispersos na região da nervura principal (fig. 7b). O limbo apresenta epiderme unisseriada constituída por células de formato retangular, recoberta por cutícula espessada (fig. 7c). A folha é hipoestomática, com estômatos inseridos ao mesmo nível das demais células epidérmicas. O mesofilo é do tipo dorsiventral, composto por três camadas de parênquima paliçádico, sendo a primeira formada por células mais volumosas e mais alongadas, e por cinco a seis camadas de parênquima esponjoso. Também é possível observar a presença de idioblastos contendo drusas (fig. 7c). Verifica-se acúmulo de compostos fenólicos (fig. 9f) e amido (fig. 9g) no parênquima paliçádico e nas células do parênquima esponjoso. Ainda, foi possível verificar a presença de compostos lipídicos na primeira camada do parênquima paliçádico e em células do parênquima esponjoso (fig. 9h). Os feixes vasculares são do tipo colateral, sendo que, os de menor calibre, encontram-se circundados por uma bainha parenquimática conspícua (fig. 7c). A região do bordo é levemente curvada para baixo e apresenta células colenquimáticas nas terminações (fig. 7d). O caule em crescimento primário apresenta epiderme unisseriada contendo gotas de óleo e revestida por cutícula espessa (fig. 10d). O córtex é formado por uma a duas camadas de células parenquimáticas, seguidas de duas a três camadas de células esclerificadas (fig. 10a). Observou-se acúmulo de conteúdo fenólico em células do floema e raios parenquimáticos (fig. 10b). Feixes vasculares medulares e idioblastos contendo drusas são encontrados na região da medula (fig. 8a, 8b). Observa-se também na região da medula o acúmulo de amido (fig. 10c). O caule em crescimento secundário (fig. 8c) apresenta suber (fig. 10g). O xilema secundário possui fibras gelatinosas (fig. 8d) e parênquima radial 37 unisseriado, floema e medula com acúmulo de compostos fenólicos (fig. 10e) e amido (fig. 10f). A medula apresenta gotas de óleo nas células parenquimáticas (fig. 10h). 6.3.2 Miconia sp.2 A folha de Miconia sp.2 apresenta pecíolo com formato côncavo na face adaxial e convexo na face abaxial em secção transversal . Adjacente à epiderme unisseriada observa-se uma a duas camadas de células parenquimáticas de formato isodiamétrico seguida de duas a seis camadas de colênquima. Drusas e esclereídes do tipo braquiesclereídes ocorrem dispersas na região do córtex e da medula (fig. 11a). No córtex, verifica-se também o acúmulo de compostos fenólicos (fig. 13a), lipídios (fig. 13b) e amido (fig. 13c), em células parenquimáticas e colenquimáticas. Os feixes vasculares são de diferentes calibres e distribuem-se em formato de arco aberto com alguns dispostos também na porção central (fig. 11a). A nervura principal, em secção transversal, apresenta-se convexa na face abaxial e plana na face adaxial. Adjacente à epiderme, observa-se três camadas de colênquima lamelar em uma porção mais central da face adaxial da nervura, enquanto na face abaxial são observadas uma a sete camadas de colênquima anelar (fig. 11b). Células do colênquima e do parênquima cortical e medular mostram acúmulo de compostos fenólicos (fig. 13e), amido (fig. 13f) e lipídicos (fig. 13g). A região vascular é composta por um feixe maior em formato de meia lua voltado para a face abaxial e três feixes reduzidos em posição adaxial (fig. 11b, fig. 13d). O limbo apresenta epiderme unisseriada constituída por células de formato retangular, recoberta por cutícula espessada (fig. 11c). A folha é anfiestomática e abaixo da epiderme verifica-se uma hipoderme constituída de células volumosas em ambas as faces. O mesofilo é do tipo dorsiventral, constituído de duas a três camadas de células mais curtas de parênquima paliçádico e sete a oito camadas de parênquima esponjoso (fig. 11c). Verifica-se o acúmulo de compostos fenólicos (fig. 13h), amido (fig. 13i) e lipídicos (fig. 13j) na hipoderme e no parênquima clorofiliano. A região do bordo possui as células hipodérmicas mais alongadas (fig. 11d). O caule, em secção transversal, mostra contorno oval quando em 38 crescimento primário (fig. 12a). A epiderme é unisseriada e apresenta tricomas tectores ramificados (fig. 12b). O córtex é formado por três camadas de células parenquimáticas, seguidas de duas a três camadas de células esclerificadas (fig. 12a, fig. 14a). Observa-se também o acúmulo de compostos fenólicos (fig. 14b), de amido (fig. 14c) e lipídios no córtex (fig. 14d). No floema, ocorrem numerosos idioblastos contendo drusas (fig. 12b). A medula é ampla, contém células esclerificadas (fig. 14a), drusas e feixes vasculares (fig. 12a). O caule em crescimento secundário possui periderme (fig. 12c), cujas células do súber apresentam paredes suberizadas (fig. 14h) e lignificadas (fig. 14e). O floema secundário acumula compostos fenólicos (fig. 14f) e amido (fig. 14g). O xilema secundário apresenta parênquima radial unisseriado com acúmulo de amido (fig. 14g) e compostos fenólicos (fig. 14f). A medula é ampla, e apresenta feixes vasculares e drusas (fig. 12d). 6.3.3 Pouteria cuspidata A folha de P. cuspidata apresenta pecíolo com formato convexo nas faces abaxial e adaxial em secção transversal. Adjacente à epiderme unisseriada, observa-se duas a três camadas de colênquima angular. Canais laticíferos ocorrem dispersos no córtex e medula (fig. 15a). Verifica-se o acúmulo de compostos fenólicos no córtex e no floema, principalmente (fig. 17a). Grãos de amido são observados em células parenquimáticas e colenquimáticas do córtex, na epiderme e no parênquima xilemático (fig. 17b). Compostos lipídios ocorrem em células epidérmicas e em células parenquimáticas do córtex e da medula (fig. 17c). Ainda, é possível verificar esclereídes dispersas no córtex (fig. 17d). O cilindro vascular central é fechado, com formato plano-convexo, envolvido por uma bainha de células esclerificadas (fig. 15a). A nervura principal possui epiderme unisseriada, em secção transversal, seguida de duas a três camadas de colênquima angular (fig. 15b). Compostos fenólicos (fig. 17e), compostos lipídicos (fig. 17f) e amido (fig. 17g) foram observados em células do parênquima cortical e medular, do floema e no xilema (fig. 17e). Canais laticíferos (fig. 15c, fig. 15d) distribuem-se no córtex e na medula. A região vascular é em formato de arco fechado envolvido por uma bainha espessa de células esclerificadas (fig. 15b). A área internervural apresenta epiderme unisseriada recoberta por cutícula 39 espessada na face adaxial. A folha é anfiestomática. O mesofilo é do tipo dorsiventral, composto por três a quatro camadas de parênquima paliçádico e oito a dez camadas de parênquima esponjoso. Canais laticíferos atravessam todo o mesofilo (fig. 15e). Verifica-se o acúmulo de compostos fenólicos (fig. 17h), amido (fig. 17i) e de lipídios (fig. 17j) na epiderme e no parênquima paliçádico e esponjoso. A região do bordo é levemente curvada para baixo e é possível observar drusas e canais laticíferos (fig. 15f). O caule em estrutura primária possui epiderme unisseriada. A instalação do felogênio ocorre na camada subepidérmica (fig. 16c). O córtex é formado por três a cinco camadas de células parenquimáticas, seguidas por uma faixa de células esclerificadas (fig. 18a), e uma região mais ampla constituída por células parenquimáticas, onde é possível encontrar diversos canais laticíferos (fig.16a, b). Além do córtex, os canais laticíferos também são encontrados dispersos no centro da medula (fig. 16a). Verifica-se o acúmulo de compostos fenólicos no parênquima cortical, nas células do floema e do xilema (fig. 18b), e amido no floema (fig. 18c). Na porção mais externa da medula, os canais laticíferos são dispostos em formato de anel próximo ao xilema primário (fig. 16a, b). O caule em crescimento secundário apresenta periderme (fig. 16d) com súber, contendo, células de paredes suberizadas (fig. 18e) e lignificadas (fig. 18f). O xilema secundário apresenta raios parenquimáticos uni a bisseriados e parênquima axial disposto em linhas, ambos com acúmulo de amido (fig. 18d). A medula é constituída essencialmente por esclereídes do tipo braquiesclereídes (fig. 18f). 6.3.4 Laplacea fruticosa A folha de L. fruticosa, em seção transversal, apresenta pecíolo com formato côncavo na face adaxial com o vértice em “v” e convexo na face abaxial. Adjacente à epiderme unisseriada, observa-se células parenquimáticas quadráticas na face adaxial, enquanto as células parenquimáticas da face abaxial apresentam formato mais isodiamétrico (fig. 19a). Astroesclereídes ocorrem dispersas na região do córtex (fig. 21b). O cilindro vascular está disposto em formato de arco aberto (fig. 19a). Verifica-se a presença de compostos fenólicos (fig. 21a) e compostos lipídicos (fig. 21c) no floema e nas células parenquimáticas do xilema. 40 A nervura principal, em secção transversal, apresenta-se côncava na face adaxial e convexa na face abaxial. Observa-se a presença de tricomas tectores unisseriados no vértice da nervura. Adjacente à epiderme, observa-se células colenquimáticas em uma porção mais central da face adaxial da nervura, enquanto na face abaxial são observadas uma a duas camadas de colênquima angular a anelar. Idioblastos contendo drusas ocorrem no córtex. O sistema vascular é composto por um feixe vascular único em formato de arco aberto voltado para a face adaxial envolvido por uma bainha esclerenquimática (fig. 19b). Verifica-se o acúmulo de compostos fenólicos (fig. 21d) nas células do floema. O limbo possui epiderme unisseriada, constituída por células de formato retangular, recoberta por cutícula espessada na face adaxial (fig. 21g). Na face abaxial, as células apresentam paredes lignificadas, sobretudo a parede periclinal interna (fig. 21h). A folha é hipoestomática. O mesofilo é do tipo dorsiventral e apresenta hipoderme com células volumosas na face adaxial seguido por duas camadas de parênquima paliçádico e seis camadas de parênquima esponjoso (fig. 19c). Verifica-se a presença de compostos fenólicos (fig. 21e), amido (fid. 21f) e compostos lipídicos (fig. 21g) em células do parênquima clorofiliano. A região do bordo é levemente curvada para baixo e apresenta uma camada de colênquima na face abaxial (fig. 19d). O caule em estrutura primária possui epiderme unisseriada. O córtex é formado por quatro a cinco camadas de células parenquimáticas, seguidas de uma a duas camadas de células esclerificadas (fig. 20a, fig. 22a). Observa-se também o acúmulo de compostos fenólicos (fig. 22b) e amido (fig. 22c) nas células do floema. A medula é formada por células parenquimáticas e astroesclereídes (fig. 20a, fig. 22a). O caule em crescimento secundário apresenta periderme, cujas células do súber apresentam paredes suberizadas (fig. 22d). O córtex é constituído por sete a oito camadas de células parenquimáticas sendo que algumas apresentam lignificação das paredes (fig. 22f). Nas células do córtex e do floema observa-se braquiesclereídes (fig. 20b) e acúmulo de amido (fig. 22e). O xilema secundário possui raios parenquimáticos predominantemente unisseriados com acúmulo de amido (fig. 22g). A medula acumula amido (fig. 22g) e apresenta astroesclereídes (fig. 22h). 41 Figura 7: Secções transversais da folha de Miconia sp.1 coradas com safrablau. a. Pecíolo. b. Nervura central. c. Área internervural. d. Bordo. Bainha do feixe (bx), colênquima (co), cutícula (ct), epiderme (ep), célula esclerificada (es), feixe vascular (fv), parênquima paliçádico (pp), parênquima esponjoso (pe), xilema (xi). As setas indicam drusas. Escala: a = 10 μm; b, c, d = 40 μm. 42 Figura 8: Secções transversais do caule de Miconia sp.1 coradas com safrablau. a-b. Caule em estrutura primária. c-d. Caule em estrutura secundária. Córtex (co), epiderme (ep), feixe vascular medular (fv), fibra gelatinosa (fg), floema (fl), medula (me), xilema (xi). As setas indicam drusas. Escala: c = 4 μm; a = 10 μm; b, d = 40 μm. 43 Figura 9: Testes histoquímicos em secções transversais da folha de Miconia sp.1. a-c. Pecíolo. d- e. Nervura central. f-h. Área internervural. Reações ao floroglucinol acidificado (a), cloreto férrico (b,d, f), lugol (c, e, g) e sudan (h). Célula esclerificada (es), colênquima (co), epiderme (ep), parênquima paliçádico (pp), parênquima esponjoso (pe). Escala: a, b, c, d, e = 10 μm; f, g, h = 40 μm. 44 Figura 10: Testes histoquímicos em secções transversais do caule de Miconia sp.1. a-d. Caule em estrutura primária. e-h. Caule em estrutura secundária. Reações ao floroglucinol acidificado (a), cloreto férrico (b,e), lugol (c, f) e sudan (d, g, h). Célula esclerificada (es), córtex (co), epiderme (ep), feixe vascular medular (fv), floema (fl), medula (me), raio parenquimático (rp), súber (su), xilema (xi). As setas indicam gotas de óleo. Escala: e, f = 10 μm; a, b, c, d, g, h = 40 μm. 45 Figura 11: Secções transversais da folha de Miconia sp.2 coradas com safrablau. a. Pecíolo. b. Nervura central. c. Área internervural. d. Bordo. Bainha do feixe (bx), célula esclerificada (es), colênquima (co), cutícula (ct), epiderme (ep), feixe vascular (fv), floema (fl), hipoderme (hp), parênquima paliçádico (pp), parênquima esponjoso (pe), xilema (xi). As setas indicam drusas. Escala: a, b = 10 μm; c, d = 40 μm. Figura 12: Secções transversais do caule de Miconia sp.2 coradas com safrablau. a-b. Caule em estrutura primária. c-d. Caule em estrutura secundária. Célula esclerificada (es), córtex (co), epiderme (ep), feixe vascular medular (fv), floema (fl), lenticela (le), medula (me), periderme (pe), tricoma (tr), xilema (xi). As setas indicam drusas. a = 4 μm; c, d = 10 μm; b = 40 μm. 46 Figura 13: Testes histoquímicos em secções transversais da folha de Miconia sp.2. a-c. Pecíolo. d-g. Nervura central. h-j. Área internervural. Reações ao cloreto férrico (a, e, h), lugol (c, f, i), sudan (b, g, j) e floroglucinol acidificado (d). Colênquima (co), epiderme (ep), hipoderme (hp), parênquima paliçádico (pp), parênquima esponjoso (pe). Escala: a, b, c, d, e, f, g = 10 μm; h, i, j = 40 μm. 47 Figura 14: Testes histoquímicos em secções transversais do caule de Miconia sp.2. a-d. Caule em estrutura primária. e-h. Caule em estrutura secundária. Reações ao floroglucinol acidificado (a, e), cloreto férrico (b, f), lugol (c, g) e sudan (d, h). Célula esclerificada (es), córtex (co), epiderme (ep), floema (fl), medula (me), raio parenquimático (rp), súber (su), xilema (xi). Escala: e, f, g, h = 10 μm; a, b, c, d = 40 μm. 48 Figura 15: Secções transversais da folha de Pouteria cuspidata coradas com safrablau. a. Pecíolo. b-d Nervura central. e. Área internervural. f. Bordo. Bainha do feixe (bx), canal laticífero (cn), colênquima (co), cutícula (ct), epiderme (ep), floema (fl), fibras (fi), medula (me), parênquima paliçádico (pp), parênquima esponjoso (pe), xilema (xi). As setas indicam drusas. Escala: a, b = 4 μm; c, d, e, f = 40 μm. 49 Figura 16: Secções transversais do caule de Pouteria cuspidata coradas com safrablau. a-c. Caule em estrutura primária. d- Caule em estrutura secundária. Célula esclerificada (es), córtex (co), felogênio (fe), floema (fl), medula (me), periderme (pe), raio parenquimático (rp), súber (su), xilema (xi). As setas indicam drusas. Escala: a = 4 μm; b = 10 μm; c, d = 40 μm. 50 Figura 17: Testes histoquímicos em secções transversais da folha de Pouteria cuspidata. a- d. Pecíolo. e-g. Nervura central. h-j Área internervural. Reações ao floroglucinol acidificado (d), cloreto férrico (a, e, h), lugol (b, g, i) e sudan (c, f, j). Célula esclerificada (es), córtex (co), epiderme (ep), medula (me), parênquima paliçádico (pp), parênqima esponjoso (pe). Escala: a, c = 4 μm; b, d, e, f, g = 10 μm; h, i, j = 40 μm. 51 Figura 18: Testes histoquímicos em secções transversais do caule de Pouteria cuspidata. a-c. Caule em estrutura primária. d-f. Caule em estrutura secundária. Reações ao floroglucinol acidificado (a, f), cloreto férrico (b), lugol (c, d) e sudan (e). Célula esclerificada (es), córtex (co), floema (fl), medula (me), periderme (pe), raio parenquimático (rp), xilema (xi). Escala: a, b, c, d, e, f = 10 μm. 52 Figura 19: Secções transversais da folha Laplacea fruticosa coradas com safrablau. a- Pecíolo. b. Nervura central. c- Área internervural. d. Bordo. Bainha do feixe (bx), célula esclerificada (es), colênquima (co), cutícula (ct), epiderme (ep), floema (fl), hipoderme (hp), parênquima paliçádico (pp), parênquima esponjoso (pe), xilema (xi). As setas indicam drusas. Escala: a, b = 10 μm; c, d = 40 μm. Figura 20: Secções transversais do caule de Laplacea fruticosa coradas com safrablau. a. Caule em estrutura primária. b. Caule em estrutura secundária. Célula esclerificada (es), córtex (co), epiderme (ep), floema (fl), fibra gelatinosa (fg), medula (me), periderme (pe), raio parenquimático (rp), xilema (xi). Escala: a, b = 40 μm. 53 Figura 21: Testes histoquímicos em secções transversais da folha de Laplacea fruticosa. a-c. Pecíolo. d. Nervura central. e-h. Área internervural. Reações ao floroglucinol acidificado (b, h), cloreto férrico (a, d, e), lugol (f), sudan (c, g). Célula esclerificada (es), epiderme (ep), floema (fl), hipoderme (hp), parênquima paliçádico (pp), parênquima esponjoso (pe). Escala: a, b, c, d = 10 μm; e, f, g, h = 40 μm. 54 Figura 22: Testes histoquímicos em secções transversais do caule de Laplacea fruticosa. a- c. Caule em estrutura primária. d-h. Caule em estrutura secundária. Reações ao floroglucinol acidificado (a, f, h), cloreto férrico (b), lugol (c, e, g), sudan (d). Célula esclerificada (es), córtex (co), floema (fl), medula (me), raio parenquimático (rp), súber (su), xilema (xi). Escala: a, b, c, d, e, f, g, h = 40 μm. 55 7. DISCUSSÃO A alta concentração de Al característica da Floresta Inundável da restinga está associada a solos ácidos (Lourenço et al., 2021). A predominância de matéria orgânica na Floresta Inundável pode ser em função da topografia que, além de ser influenciada pelo afloramento do lençol freático, recebe aporte de compostos orgânicos vindos da floresta adjacente e/ou da formação de serapilheira proveniente da própria floresta (Rocha, 2012). As plantas podem lidar com as altas concentrações de Al por meio de mecanismos de exclusão e/ou detoxificação deste metal (Schmitt et al., 2016a). No presente estudo, a análise química de Al em folhas revelou três espécies acumuladoras de Al na restinga, Miconia sp.1, Miconia sp.2 (Melastomataceae) e L. fruticosa (Theaceae). Melastomataceae é uma das famílias com maior número de espécies acumuladoras de Al entre as angiospermas (Jansen et al., 2002a), sendo Miconia um forte acumulador (Jansen et al., 2002a; Bressan et al., 2016). O estudo em questão reforça essa constatação, sendo os representantes que mostraram maior acúmulo desse metal. A familia Theaceae também possui alguns representantes acumuladores de Al (Jansen et al. 2002b), sendo que este estudo registra pela primeira vez, L. fruticosa como acumuladora de Al. Cabe ressaltar que, embora P. cuspidata (Sapotaceae) não tenha mostrado teor de Al acima de 1000 mg/kg-¹ de massa seca foliar, essa espécie mostrou alto teor de Al no látex (4991 mg/kg-¹) (Tabela 2). A presença de laticíferos articulados é considerada uma característica diagnóstica para o Sapotaceae (Metcalfe e Chalk, 1972). Os laticíferos são células alongadas, produtoras e armazenadoras de látex que podem se ramificar para regiões do córtex, da medula, do mesofilo foliar e, em especial, dos tecidos vasculares (Metcalfe e Chalk, 1972; Ferreira, 2020). Sapotaceae é relatada como uma família com poucos representantes acumuladores de Al (Jansen, 2004, Masunaga, 1998), portanto, a presença do Al no látex pode indicar um mecanismo de tolerância para da espécie. Sabe-se que o látex é uma suspensão coloidal formada por uma mistura de pequenas partículas (óleos, resinas, ceras e borracha) dispersas num líquido que contém mucilagem, carboidratos, ácidos orgânicos e íons minerais (Castro e Machado, 2006). Pouco é conhecido sobre a presença de Al no látex, neste trabalho, sugere-se que esse metal pode estar contido no látex em forma de íons, 56 complexado com ácidos orgânicos ou em uma ligação Al-mucilagem. Isso porque, segundo Watanabe et al. (2008), a mucilagem exsudada pelas raízes de Melastoma malabathricum têm maiores afinidade para cátions trivalentes (Al³+) e contém ácido urônico e pectina. Sendo assim, os grupos carboxila deste ácido e da pectina podem se ligar a cátions metálicos como o Al. Nesse estudo o Al foi encontrado, em geral, em maiores concentrações nas folhas em relação aos caules, corroborando os estudos de Jansen et al. (2003), Shen et al. (2006) e Olivares et al. (2010). Essa característica parece ser devido ao alto conteúdo de pectina na parede celular primária das folhas. A pectina possui um grande número de grupos carboxílicos carregados negativamente que são considerados os principais locais de ligação de Al (Chang et al., 2002). Além disso, a hemicelulose pode ser considerada um sítio alternativo de ligação do Al (Yang et al., 2011). A análise histoquímica revelou que o Al foi encontrado predominantemente impregnando paredes celulares, podendo também se acumular no conteúdo de algumas células. A presença de Al em células lignificadas não é muito comum, mas já foi relatado para elementos de vaso em processo de diferenciação e à parede mais interna de fibras gelatinosas, como observado em espécies de Miconia (Milanez et al., 2017) e em células do xilema primário de Camellia oleifera (Zeng et al., 2012). Nesse estudo, também observou-se acúmulo do Al em elementos de vaso e fibras gelatinosas de P. cuspidata e Miconia sp.1, respectivamente. No presente trabalho, a identificação de células parenquimáticas como sítios de acúmulo do Al foi comum. Vários trabalhos relatam a presença desse metal em células do parênquima paliçádico e esponjoso (Júnior, 2012; Rosa, 2018), parênquima cortical e medular (Júnior, 2012; Zeng et al., 2012; Bressan et al., 2016) e parênquima radial floemático e xilemático (Schmitt et al., 2016b; Milanez et al., 2017). No parênquima clorofiliano, também foi observada a presença de Al em cloroplastos. Alguns trabalhos mostram que a presença desse elemento não causa danos na morfofisiologia de cloroplastos nas acumuladoras Rudgea viburnoides (Malta et al., 2016; Santana, 2017) e Qualea grandiflora (Andrade et al., 2011). No parênquima radial, Schimitt et al. (2016b), sugerem que o Al contido no parênquima radial seja transportado radialmente para os tecidos da casca de Symplocos paniculata, indicando uma interação potencial https://internal-journal.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2016.00039/full#B47 57 entre o xilema e o floema no transporte de Al. Em células do floema de Camellia oleifera, Zeng et al. (2012) fornecem evidências de que as células do floema podem funcionar como caminho para a translocação do Al. Em L. fruticosa (Theaceae), foi verificado que a epiderme e a hipoderme foram os sítios de acúmulo de Al. Segundo Carr et al. (2003) e Tolrà et al. (2011), células epidérmicas e do mesofilo são sítios preferenciais de acúmulo do Al em Camellia sinensis (Theaceae), o que é considerado como um mecanismo responsável pela detoxificação, visto que essas células não participam da fotossíntese. Nessa espécie, células epidérmicas mostram-se como um importante local de acúmulo do Al em folhas e esse padrão também foi observado em outras espécies acumuladoras, como Rudgea viburnoides (Rubiaceae) e Qualea grandiflora (Vochysiaceae) (Rosa, 2018). O acúmulo de compostos fenólicos e lipídicos ocorre frequentemente em sítios semelhantes em Miconia sp.1 e Miconia sp.2, estas espécies compartilham sítios semelhantes de acúmulo de compostos fenólicos, lipídicos e Al. Alguns autores sugerem que a presença de compostos fenólicos possuem uma função na detoxificação de Al (Ofei-manu et al., 2001; Nagata et al., 2002; Da Silva et al., 2008). Os estudos supracitados corroboram com Ofei-manu et al. (2001), já que seus resultados mostram que existe uma relação positiva entre a concentração de compostos fenólicos e a tolerância ao Al em dez espécies lenhosas, incluindo espécies acumuladoras e não acumuladoras. Pilon-Smits et al. (2009) sugerem que o acúmulo de Al nos tecidos vegetais em espécies hiperacumuladoras (10000 mg/kg-1 de Al) pode aumentar a resistência a fatores bióticos e abióticos. Nesse sentido, trabalhos futuros envolvendo a avaliação entre o acúmulo de Al e a tolerância aos fatores ambientais observados na Floresta Inundável são pertinentes. A presença de células esclerificadas no córtex e na medula caulinar das espécies acumuladoras parece ser uma característica comum entre elas. O acúmulo de lignina em tecidos vegetais pode ser associado, além de fatores ambientais, à presença de Al3+. O Al3+ é capaz de induzir a expressão gênica que codifica uma proteína com alta homologia de sequência para a fenilalanina amônia-liase (PAL), enzima considerada precursora da síntese de substâncias fenólicas (Snowden e Gardner, 1993). Peixoto et al., 2007 constataram aumento nos teores de lignina e de outros compostos fenólicos nos ápices radiculares de 58 sorgo e considerou uma indicação de tolerância ao Al3+. Neste caso, a lignina pode estar associada ao mecanismo de tolerância ao acúmulo do metal nos tecidos das plantas em estudo. As espécies acumuladoras de alumínio estudadas possuem folhas membranáceas exceto, P. cuspidata cujas folhas são coriáceas. Em geral, as espécies estudadas possuem características anatômicas mesomórficas, mas algumas características xeromórficas foram observadas, como a presença de células esclerificadas, cutícula espessa e hipoderme. Trabalhos clássicos como os realizados por Arens (1963) e Goodland (1971) descrevem plantas nativas do Cerrado como escleromórficas e relacionam a presença de células esclerenquimáticas, cutícula bem desenvolvida, hipoderme e periderme espessa com alta saturação de alumínio nos solos. As Restingas são ecossistemas onde a vegetação se encontra sobre solos arenosos, lixiviados e pobres em nutrientes (Araújo et al., 2004). Segundo Ferri (1999), mesmo que alguns ambientes sejam extremamente úmidos, é possível a existência de caracteres xeromórficos. Muitas vezes, quando isso ocorre é devido à pobreza de nutrientes dos solos e às altas concentrações de Al, sendo caracterizado como um fenômeno xeromórfico oligotrófico (Ferri, 1999). 59 8. CONCLUSÕES Conclui-se que das 28 espécies lenhosas avaliadas na Floresta Inundável de restinga, três são efetivamente acumuladoras de alumínio, apresentando teores de Al acima de 1000 mg/kg-¹ de massa seca foliar, sendo elas Miconia sp.1, Miconia sp.2 e L. fruticosa. Embora P. cuspidata não tenha mostrado teor de Al acima de 1000 mg/kg-¹ de massa seca foliar, essa espécie mostrou alto teor de Al no látex (4991 mg/kg-¹), sendo assim, incluímos essa espécie às demais acumuladoras. O acúmulo de Al ocorreu preferencialmente nas folhas, em relação aos caules. Os resultados mostraram que os principais sítios de acúmulo de Al são paredes primárias, ricas em pectina; camadas mais internas da parede secundária de fibras gelatinosas e lume celular de células da epiderme, parênquima clorofiliano, colênquima, floema e raios xilemáticos. 60 REFERÊNCIAS ALVARES, C.A.; STAPE, J.L.; SENTELHAS, P.C.; GONCALVES, J.L.M.; SPAROVEK, G. Ko¨ppen‟s climate classification map for Brazil. Meteorologische Zeitschrift, v. 22, n. 6, p. 711-728, 2013. ANDRADE, L.R.M.; BARROS, L.M.G.; ECHEVARRIA, G.F.; DO AMARAL, L.I.V.; COTTA, M.G.; ROSSATTO, D.R.; HARIDASAN, M.; FRANCO, A.C. Al- Hyperaccumulator Vochysiaceae from the Brazilian Cerrado store aluminum in their chloroplasts without apparent damage. Environmental and Experimental Botany, v. 70, p. 37-42, 2011. ARAUJO, D.S.D. Análise florística e fitogeográfica das restingas do Estado do Rio de Janeiro. 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