UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA Microdispositivos a Base de Papel para análise de Drogas de Abuso Paper-based microdevices for abused drugs analysis Jadson Zeni dos Reis Tese de Doutorado em Química Vitória 2024 Jadson Zeni dos Reis Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química do Centro de Ciências Exatas da Universidade Federal do Espírito Santo como requisito parcial para obtenção do Título de Doutor em Química Área de Concentração: Química Linha de Pesquisa: Química Forense Orientador: Prof. Dr. Wanderson Romão VITÓRIA 2024 Ficha catalográfica disponibilizada pelo Sistema Integrado de Bibliotecas - SIBI/UFES e elaborada pelo autor ___________________________________________________________________ Reis, Jadson, 1988- R375m Microdispositivos a base de papel para análise de drogas de abuso / Jadson Reis. - 2024. 98 f.: il. Orientador: Wanderson Romão. Tese (Doutorado em Química) - Universidade Federal do Espírito Santo, Centro de Ciências Exatas. 1. Microdispositivos de Papel. 2. Quimiometria. 3. Drogas de abuso. I. Romão, Wanderson. II. Universidade Federal do Espírito Santo. Centro de Ciências Exatas. III. Título. CDU: 54 ___________________________________________________________________ Microdispositivos a Base de Papel para análise de Drogas de Abuso Jadson Zeni dos Reis Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em Química do Centro de Ciências Exatas da Universidade Federal do Espírito Santo como requisito parcial para a obtenção do Grau de Doutor(a) em Química. Aprovada em 29/02/2024 por: ________________________________________________ Prof.(a) Dr.(a) Wanderson Romão Orientador(a) UFES ________________________________________________ Prof.(a) Dr.(a) Hildegardo Seibert França IFES ________________________________________________ Prof.(a) Dr.(a) Thalles Ramon Rosa IFES ________________________________________________ Prof.(a) Dr.(a) Paulo Roberto Filgueiras UFES ________________________________________________ Prof.(a) Dr.(a) Rodrigo Rezende Kitagawa UFES Universidade Federal do Espírito Santo Vitória, fevereiro de 2024 DOCUMENTO ASSINADO ELETRONICAMENTE NOS MOLDES DO ART. 10 DA MP 2200/01 E LEI 14063/20 [Hash SHA256] e1044b3db1c106051f05380227e165d8e49f755ac8acd509eb636fcc1755478d UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO Centro de Ciências Exatas Programa de Pós-Graduação em Química 76ª ATA DE DEFESA DE TESE DE DOUTORADO EM QUÍMICA Ata da sessão de defesa da 76ª Tese de Doutorado em Química do Centro de Ciências Exatas da Universidade Federal do Espírito Santo, do(a) aluno(a) Jadson Zeni dos Reis, candidato(a) ao grau de Doutor(a) em Química. Às 08:00 horas do dia 29/02/2024, no link: https://conferenciaweb.rnp.br/conference/rooms/jadson-zeni-dos-reis/invite?show-suggestion= false, o(a) Presidente da Comissão Examinadora, Prof.(a) Dr.(a) Wanderson Romão – UFES, iniciou a sessão apresentando a Comissão constituída, além dele(a) próprio(a) que é o(a) Orientador(a), e pelos outros membros que são o(a) Prof.(a) Dr.(a) Hildegardo Seibert França (Examinador(a) Externo(a)) – IFES, o(a) Prof.(a) Dr.(a) Thalles Ramon Rosa (Examinador(a) Externo(a)) – IFES, o(a) Prof.(a) Dr.(a) Paulo Roberto Filgueiras (Examinador(a) Interno(a)) – UFES e o(a) Prof.(a) Dr.(a) Rodrigo Rezende Kitagawa (Examinador(a) Interno(a)) – UFES. A seguir, o(a) presidente passou a palavra ao(à) candidato(a) que, em 50 minutos, apresentou a sua tese intitulada “Microdispositivos a Base de Papel para análise de Drogas de Abuso”. Finda a apresentação, o(a) presidente passou a palavra aos membros da Comissão para procederem à arguição do(a) candidato(a). Finda a arguição, o(a) presidente convidou a Comissão para dirigir-se a uma sala reservada, para deliberação. Após a deliberação, a Comissão retornou e o(a) presidente informou aos presentes que a tese fora aprovada. Logo após, o(a) presidente declarou encerrada a sessão, e eu, Wanderson Romão, lavrei a presente Ata, que é assinada pelos membros da Comissão Examinadora. Vitória, 29/02/2024. _______________________________________________________________ Prof.(a) Dr.(a) Wanderson Romão1 UFES – Orientador(a) _______________________________________________________________ Prof.(a) Dr.(a) Hildegardo Seibert França IFES – Titular Externo _______________________________________________________________ Prof.(a) Dr.(a) Thalles Ramon Rosa IFES – Titular Externo _______________________________________________________________ Prof.(a) Dr.(a) Paulo Roberto Filgueiras UFES– Titular Interno _______________________________________________________________ Prof.(a) Dr.(a) Rodrigo Rezende Kitagawa UFES – Titular Interno 1 O documento será assinado eletronicamente em conformidade com as normas prescritas na Portaria Normativa PRPPG/ UFES nº 08/2021. Campus Universitário Alaor de Queiroz Araújo – Av. Fernando Ferrari, 514 – Goiabeiras, Vitória – ES │ 29075-910 │ │ WWW.QUIMICA.VITORIA.UFES.BR │ PPGQ.UFES@GMAIL.COM Documento assinado eletronicamente nos moldes do art. 10 da MP 2200/01 e Lei 14063/20 [Hash SHA256] e1044b3db1c106051f05380227e165d8e49f755ac8acd509eb636fcc1755478d UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO Centro de Ciências Exatas Programa de Pós-Graduação em Química REGISTRO DE JULGAMENTO DA TESE DO(A) CANDIDATO(A) AO GRAU DE DOUTOR(A) PELO PPGQUI/ UFES A Comissão Examinadora da Tese de Doutorado intitulada “Microdispositivos a Base de Papel para análise de Drogas de Abuso”, elaborada por Jadson Zeni dos Reis, candidato(a) ao Grau de Doutor(a) em Química, recomendou, após a apresentação da Tese realizada no dia 29/02/2024, que ela seja (assinale um dos itens abaixo): (x) Aprovada ___________________________________________________________________________ ( ) Reprovada ___________________________________________________________________________ Os membros da Comissão deverão indicar a natureza de sua decisão através de sua assinatura2 na coluna apropriada que segue: Aprovada Reprovada ---------------------------------- ------------------------------ ---------------------------------- ------------------------------ ---------------------------------- ------------------------------ ---------------------------------- ------------------------------ ---------------------------------- ------------------------------ ---------------------------------- ------------------------------ 2 O documento será assinado eletronicamente em conformidade com as normas prescritas na Portaria Normativa PRPPG/ UFES nº 08/2021. Campus Universitário Alaor de Queiroz Araújo – Av. Fernando Ferrari, 514 – Goiabeiras, Vitória – ES │ 29075-910 │ │ WWW.QUIMICA.VITORIA.UFES.BR │ PPGQ.UFES@GMAIL.COM Documento assinado eletronicamente nos moldes do art. 10 da MP 2200/01 e Lei 14063/20 [Hash SHA256] e1044b3db1c106051f05380227e165d8e49f755ac8acd509eb636fcc1755478d Datas e horários baseados em Brasília, Brasil Sincronizado com o NTP.br e Observatório Nacional (ON) em Os registros de assinatura presentes nesse documento pertencem única e exclusivamente a esse envelope. Documento final gerado e certificado por Documento em conformidade com o padrão de assinatura digital ICP - Brasil e validado de acordo com o Instituto Nacional de Tecnologia da Informação Universidade Federal do Espírito Santo /03/2024 às 14:48:38 05 Documentos Banca de Defesa de Doutorado Aluno Jadson Zeni dos Reis Data e Hora de Criação: 05/03/2024 às 09:01:03 Documentos que originaram esse envelope: - DocumentosDefesa_Jadson Zeni dos Reis.pdf (Arquivo PDF) - 3 página(s ) Hashs únicas referente à esse envelope de documentos [ SHA256]: e1044b3db1c106051f05380227e165d8e49f755ac8acd509eb636fcc1755478d [ SHA512]: b9ae8b6a2e6be5ed0aa01edfa551ba42f0c08fb67e4b4c2d411c4c28ff02fefd8c760ce5a50ffa1dce474089a76be0faedceefa788acdb02d2e97ca4b88260b 5 Lista de assinaturas solicitadas e associadas à esse envelope ASSINADO - Hildegardo Seibert França (hildegardo.franca@ifes.edu.br) Data/Hora: 05/03/2024 - 12:10:19, IP: 200.173.85.114 [ SHA256]: 5a9ac0134b4e8a0ffc72d797f8afb47295e8f5f95ece29d2c0750be0154bb73d ASSINADO - Paulo Roberto Filgueiras (paulo.filgueiras@ufes.br) Data/Hora: 05/03/2024 - 10:20:16, IP: 200.137.65.103 [ SHA256]: 07c55e52628259379d259d07852f444e6f18994e46178b14506564b1b5ee33a 3 ASSINADO - Rodrigo Rezende Kitagawa (rodrigo.kitagawa@ufes.br) Data/Hora: 05/03/2024 - 09:48:32, IP: 177.137.224.225, Geolocalização: [-20.333512, -40.281163] 146 [ SHA256]: 84197d710b2d0049fc4f988897e0f4556a2275e610c7020606978eb9b61ca ASSINADO - Thalles Ramon Rosa (thalles.rosa@ifes.edu.br) Data/Hora: 05/03/2024 - 14:48:38, IP: 177.159.78.131, Geolocalização: [-19.832627, -40.257779] [ 4 SHA256]: ef05f259cd9ec2351e4220859e53b1715dd2f75b48950d078c7c68d8d71db0f ASSINADO - Wanderson Romão (wandersonromao@gmail.com) Data/Hora: 05/03/2024 - 09:28:47, IP: 200.137.75.113, Geolocalização: [-20.348114, -40.308229] 561b45b0234d637935d1227f5514 SHA256]: ff1a95550ada91d3e227db63298fb910eeda [ Histórico de eventos registrados neste envelope 05 /03/2024 14:48:38 - Envelope finalizado por thalles.rosa@ifes.edu.br, IP 177.159.78.131 05 /03/2024 14:48:38 - Assinatura realizada por thalles.rosa@ifes.edu.br, IP 177.159.78.131 /03/2024 14:48:32 - Envelope visualizado por thalles.rosa@ifes.edu.br, IP 177.159.78.131 05 05 /03/2024 12:10:19 - Assinatura realizada por hildegardo.franca@ifes.edu.br, IP 200.173.85.114 05 200.173.85.114 /03/2024 12:10:13 - Envelope visualizado por hildegardo.franca@ifes.edu.br, IP 200.137.65.103 /03/2024 10:20:16 - Assinatura realizada por paulo.filgueiras@ufes.br, IP 05 177.137.224.225 /03/2024 09:48:32 - Assinatura realizada por rodrigo.kitagawa@ufes.br, IP 05 177.137.224.225 /03/2024 09:48:27 - Envelope visualizado por rodrigo.kitagawa@ufes.br, IP 05 /03/2024 09:28:47 - Assinatura realizada por wandersonromao@gmail.com, IP 05 200.137.75.113 05 /03/2024 09:28:38 - Envelope visualizado por wandersonromao@gmail.com, IP 200.137.75.113 05 /03/2024 09:07:25 - Envelope registrado na Blockchain por michel.chaves@ufes.br, IP 200.137.65.103 05 /03/2024 09:07:21 - Envelope encaminhado para assinaturas por michel.chaves@ufes.br, IP 200.137.65.103 /03/2024 09:01:04 - Envelope criado por michel.chaves@ufes.br, IP 200.137.65.103 05 Dedico este trabalho à minha amada esposa que sempre esteve ao meu lado dando todo suporte possível. Dedico também a minha família por todo esforço para que eu pudesse estudar e chegar até aqui. Aos meus colegas de laboratório por toda assistência e ao meu orientador por toda orientação e dedicação nesse processo tão importante da minha vida. AGRADECIMENTOS Agradeço à Universidade Federal do Espírito Santo pela suporte técnico-científico, à Polícia Civil do Espírito Santo que por parceria forneceu as amostras. Ao professor Wanderson Romão pela orientação e a todos do Núcleo de Competências em Química do Petróleo da UFES, em destaque ao LabPetro. “A mente que se abre a uma nova ideia jamais voltará ao seu tamanho original" Albert Einstein LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 – Percentual de escolares de 13 a 17 anos que experimentaram drogas ilícitas alguma vez na vida, com indicação do intervalo de confiança de 95%, segundo as Unidades da Federação – 2019.............................................................18 FIGURA 2 – Reação negativa (à esquerda) e reação positiva (à direita) para a cocaína, mediante o uso do reagente de tiocianato de cobalto II..............................20 FIGURA 3 – Representação dos três principais canabinoides e suas colorações perante solução de Fast Blue B.................................................................................23 FIGURA 4 – Resultado da Web of Science por ano de publicação para a combinação das palavras “Drugs and Colorimetry”...................................................25 FIGURA 5 – Esquema de análise em espectrômetro de massas.............................28 FIGURA 6 – Composição de cores do sistema RGB e suas intensidades................31 FIGURA 7 – Resultado da Web of Science por ano de publicação apenas para a Química para a expressão “RGB System”.................................................................32 FIGURA 8 – Interface do aplicativo Photometrix para smartphones.........................35 FIGURA 9 – Microcontrolador digital.........................................................................36 FIGURA 10 – Microdispositivo sofisticado com processador (LOC).........................37 FIGURA 11 – Microdispositivo a base de papel........................................................38 FIGURA 12 – Resultado da Web of Science por ano de publicação para a expressão “microfluidic paper-based analytical devices”............................................................39 FIGURA 13 – Microdispositivo a base de papel para análise forense.......................40 FIGURA 14 – Superfície de resposta com a desejabilidade em função do diâmetro e da porcentagem de tiocianato....................................................................................45 FIGURA 15 – Classificação de amostras por Análise de Componentes Principais..47 FIGURA 16 – Resultado da Web of Science por ano de publicação para o refino “Colorimetric and Microfluidic and Drugs and Paper”.................................................49 FIGURA 17 – Resultado da Web of Science por área para o refino “Colorimetric and Microfluidic and Drugs and Paper”.............................................................................50 FIGURA 18 – Nuvem de palavra resultante da construção com as palavras “Colorimetric and Microfluidic and Drugs and Paper” no bibliometrix........................51 FIGURA 19 – Árvore de palavras resultante da construção com as palavras “Colorimetric and Microfluidic and Drugs and Paper” no bibliometrix........................51 FIGURA 20 – Apresentação de Otimização de μPADs.............................................54 FIGURA 21 – Gráfico de Pareto obtido do planejamento cujo a hora de espera para a fotografia foi de 1 hora............................................................................................61 FIGURA 22 – Superfícies de resposta da concentração de cloridrato (A) versus diâmetro do spot; e (B) diâmetro do ponto versus % de tiocianato de cobalto II.......62 FIGURA 23 – Resultado do teste de Scott modificado utilizando os dispositivos µPADs para amostras apreendidas de cocaína e crack............................................63 FIGURA 24 – Curva analítica do cloridrato de cocaína construída por PLS.............64 FIGURA 25 – Gráfico de frequência das concentrações de cloridrato para amostras de cocaína e crack.....................................................................................................66 FIGURA 26 – Gráfico PC1 vs PC3 para cocaína e crack (representados pelos símbolos Cn e Kn, respectivamente. Com cargas que explicam 80,6% da variância.....................................................................................................................67 FIGURA 27 – Fotografia do teste finalizado de amostras de maconha apreendidas – nomeadas de n = 1 a 66 – e soluções do padrão CBN nas concentrações de 1 a 30 mg mL-1, sendo denominadas C1, C2, C3, C5, C10, C15 e C30...............................69 FIGURA 28 – Curva de calibração construída por PLS para predição de [CBN], em mg mL-1......................................................................................................................70 FIGURA 29 – PCA de amostras apreendidas de maconha (n = 66) com agrupamento temporal (PC1 × PC2)...........................................................................72 FIGURA 30 – Número de amostras de maconha apreendidas (n = 66) em função da detecção de CBD, CBN e Δ9-THC (em mAU)............................................................73 FIGURA 31 – Cromatograma de extrato de Canabis de amostra de maconha apreendida, em que (a) representa uma curva com os padrões de mistura equimolar e (b) um extrato típico de Canabis de amostra de maconha, amostra 20.................74 FIGURA 32 – Curva de calibração construída por CLAE para [CBN], em mg mL-1..75 FIGURA 33 – Estrutura molecular dos compostos....................................................76 LISTA DE TABELAS TABELA 1 – Levantamento bibliográfico referente aos artigos publicados utilizando como palavra-chave "Photometrix" na base de dados Web of Science....................41 TABELA 2 – Planejamento fatorial experimental com 3 fatores...............................55 TABELA 3 – Concentrações de cloridrato (mg mL-1 e% em massa) em amostras de crack...........................................................................................................................65 TABELA 4 – Concentrações de cloridrato (mg mL-1 e% em peso) em amostras de cocaína.......................................................................................................................66 LISTA DE ABREVIATURAS µPAD – Micropaper-based analytical device OMS – Organização Mundial de Saúde SNC – Sistema Nervoso Central PeNSE - Pesquisas Nacionais de Saúde do Escolar IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística MDMA – 3,4-metilenodioximetanfetamina LSD – Lysergic Acid Diethylamide II LENAD - II Levantamento Nacional de Álcool e Drogas 2012 CBD – Canabidiol CBN – Canabinol Δ9-THC – Δ9-tetrahidrocanabinol SIDA – Síndrome de Imunodeficiência Adquirida CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência RGB – Red, Green and Blue CCD – Charge-Coupled Device CMOS – Complementary Metal Oxide Semiconductor µTAS – micro total analysis system LOC – Lab On Chip MIA – Multivariate Image Analysis PCA – Principal Components Analysis PLS – Partial Least Squares HCA - Hierarchical Cluster Analysis DOE – Design of Experiment CCD – Central Composite Design BBD – Box-Behnken Design FTIR – Fourier Transform Infrared Spectroscopy UV-VIS – Ultravioleta Visível MPCA – multiway principal component analysis ANOVA – Análise da Variância PC-ES – Polícia Civil do Espírito Santo SWGDRUG – Scientific Working Group for the Analysis of Seized Drugs RMSEC – Root Mean Square Error of Calibration LOD – Limit On Detection LOQ – Limit On Quantification RESUMO O crescente consumo de drogas ilícitas no Brasil tem preocupado a sociedade, os recursos utilizados pelos traficantes estão evoluindo exponencialmente. Dessa forma, se faz necessário que a tecnologia usada para combate as drogas também evolua. As principais drogas no país são compostas por um número elevado de substâncias e analisá-las demanda trabalho. Uma das técnicas modernas capaz de discernir as substâncias em uma mistura é a microfluídica, esta é atribuída a pequenas amostras de fluido em pequenos canais. A técnica possui vertentes sendo a de maior destaque a que usa papel, uma vez que é mais barata. Neste trabalho a microfluídica em papel foi revisada para a aplicação em dois testes, sendo o primeiro o de Scott modificado a fim de calcular o teor de cloridrato em amostras apreendidas de cocaína e de crack. O outro teste aplicado usa de uma solução de Tiocianato de Cobalto II, teste com Fast Blue B, para avaliar o teor de alguns dos canabinoides presentes em amostras de maconha. Contudo, a pura análise visual da resposta colorimétrica é influenciada por diversos fatores, daí o uso de câmera fotográfica de smartphone para tornar a técnica mais precisa. No entanto, como qualquer análise química o teste de Scott, e o teste com Fast Blue B possuem mutáveis e variá-las separadamente é um trabalho muito dispendioso que destoa à realidade. Dessa forma, para minimizar tal problema o trabalho foi assistido por um planejamento experimental no modelo fatorial na busca por condições ótimas de tamanho de spot e teor de reagentes, influentes nos resultados. Outras ferramentas quimiométricas como análise por componentes principais e por mínimos quadrados parciais serviram para avaliar se as amostras se agrupam e uma possível predição de respostas. É interessante destacar ainda, que a alta seletividade do µPAD, do inglês Micropaper-based analytical device, sugere a possibilidade do uso da técnica na identificação desses entorpecentes mesmo em dissolução com líquidos escuros. Palavras-chave: Microfluídica. Colorimetria. Análise multivariada. ABSTRACT The growing consumption of illicit drugs in Brazil has worried society, the resources used by drug traffickers are evolving exponentially. Therefore, it is necessary that the technology used to combat drugs also evolves. The main drugs in the country are made up of a large number of substances and analyzing them requires work. One of the modern techniques capable of discerning substances in a mixture is microfluidics, which is attributed to small samples of fluid in small channels. The technique has aspects, the most prominent being the one that uses paper, as it is cheaper. In this work, paper microfluidics was revised for application in two tests, the first being modified by Scott in order to calculate the hydrochloride content in seized samples of cocaine and crack. The other test applied uses a Cobalt II Thiocyanate solution, test with Fast Blue B, to evaluate the content of some of the cannabinoids present in marijuana samples. However, the pure visual analysis of the colorimetric response is influenced by several factors, hence the use of a smartphone camera to make the technique more precise. However, like any chemical analysis, the Scott test and the Fast Blue B test have variables and varying them separately is very expensive work that clashes with reality. Therefore, to minimize this problem, the work was assisted by experimental planning in the factorial model in the search for optimal conditions for spot size and reagent content, which influence the results. Other chemometric tools such as principal component analysis and partial least squares were used to evaluate whether the samples grouped together and a possible prediction of responses. It is also interesting to highlight that the high selectivity of the µPAD, Micropaper-based analytical device, suggests the possibility of using the technique to identify these narcotics even when dissolved in dark liquids. Key words: Microfluidics. Colorimetry. Multivariate analysis. 19 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. .21 1.1 As drogas de abuso .............................................................................21 1.2 As Ciências Forense ............................................................................ 26 1.3 Gerando a imagem digital .................................................................... 29 1.4 O uso de smartphones na química ...................................................... 32 1.5 Microfluídica......................................................................................... 35 1.5.1 Microfluidic Paper-Based Analytical Devices................................41 1.6 Quimiometria aplicada ......................................................................... 44 2. OBJETIVOS .................................................................................................. 53 2.1 Geral .................................................................................................... 53 2.2 Específicos .......................................................................................... 53 3. METODOLOGIA ........................................................................................... 54 3.1 Amostras de Cocaína e Crack ............................................................. 54 3.1.1 Otimização e construção dos µPADs............................................54 3.1.2 Amostras analisadas.....................................................................56 3.1.3 Aplicação do Photometrix..............................................................56 3.2 Amostras de Maconha...........................................................................57 3.2.1 Construção dos µPADs.................................................................57 3.2.2 Amostras analisadas.....................................................................57 3.2.3 Aplicação do Photometrix..............................................................58 3.2.4 Análise por CLAE..........................................................................59 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................... 60 4.1 Amostras de Cocaína e Crack ............................................................. 60 4.1.1 Otimização e construção dos µPADs............................................60 4.1.2 Análise das amostras apreendidas...............................................62 4.2 Amostras de Maconha ......................................................................... 68 4.2.1 Análise das amostras apreendidas por µPADs.............................68 4.2.2 Análise das amostras apreendidas por CLAE...............................72 4.2.3 Correlação dos resultados obtidos por µPADs e CLAE................76 5. CONCLUSÃO ............................................................................................... 78 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................. 80 20 ANEXOS ........................................................................................................... 88 21 1. INTRODUÇÃO 1.1 As drogas de abuso A sociedade moderna não é uma exclusividade para o uso de drogas lícitas e ilícitas, o uso de substâncias psicoativas é mencionado nos livros de histórias desde os primórdios da humanidade, seja para a socialização em grandes eventos em palácios quanto para tratamento de doenças. A história, então, nos diz que as drogas, sejam lícitas ou não, fazem parte da sociedade desde mesmo de antes da escrita, o consumo de álcool por exemplo é datado de 6000 anos antes de Cristo segundo pesquisas arqueológicas1. Além disso, se muitas são as razões para o uso de drogas, também foram várias as formas que a sociedade adotou para avaliar esse consumo2. O termo droga é recorrente na história, isso pois iniciou como sinônimo de remédio, a palavra droga se origina da expressão droog (holandês antigo) que significa “folha seca”, isso porque, antigamente, a maioria dos medicamentos era à base de vegetais/ervas/folhas e assim gerava a capacidade de eliminar a dor e de afastar os problemas3. Dessa forma, os primeiros passos recordam o desenvolvimento para exercer uma situação benéfica à sociedade. O desenvolvimento de substâncias que aliviam a dor ou que combatem doenças é uma evolução humana, porém o problema se inicia com o uso inadequado de tal conhecimento. A origem da palavra droga já foi aqui relata, mas sua definição sofreu alterações, hoje, de acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS) o termo droga é definido como toda substância que introduzida no organismo vivo modifica uma ou mais das suas funções. Isso se fez necessário em virtude da disseminação elevada das drogas classificadas como ilícitas, haja visto o uso destas para fugir de crises psicológicas e mesmo da própria realidade5. Já na Medicina e na Farmacologia, a expressão droga faz referência a qualquer substância que previne ou cura doenças ao provocar alterações fisiológicas nos organismos. Quanto ao sentido corrente diário, o termo “droga” refere-se em geral às substâncias ilícitas que provocam dependência, afetam o Sistema Nervoso Central (SNC) e modificam as sensações e o comportamento do indivíduo. É visto ainda, que na visão diária, substâncias lícitas, aquelas permitidas por lei, como o álcool, o tabaco e os medicamentos que possuem tarja preta na sua embalagem não são vistas como drogas já que são permitidas pelo governo6. Também denominadas entorpecentes ou narcóticos, as drogas ilícitas podem ser: (I) Naturais: aquelas obtidas in natura, por exemplo, da planta Canabis sativa, conhecida popularmente como maconha, do fruto da Papoula se 22 obtém o ópio. (II) Semissintéticas: feitas usando plantas, porém passam por processos químicos em laboratórios, como exemplo tem-se heroína, derivada da morfina. (III) Sintéticas: são totalmente produzidas em laboratórios seguindo técnicas específicas, tal como ecstasy e anfetamina6. No que se refere a drogas ilícitas a maior parte dos países assumiu medidas de repreensão pesadas, o proibicionismo e/ou o sistema de guerra às drogas. A estratégia prioriza a redução da oferta de drogas e relega a segundo plano a prevenção ao uso, tendo como principais pilares o modelo moral e criminal, que preconiza o enfrentamento das drogas pelo encarceramento dos usuários, e o modelo de doença, segundo o qual a dependência de drogas é tratada como uma patologia de origem biológica7. No Brasil, drogas lícitas e ilícitas são vendidas com grande frequência. Uma das últimas Pesquisas Nacionais de Saúde do Escolar (PeNSE) realizada em 2019 pelo Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) diz que a experimentação de bebidas alcoólicas foi de 63,3% para os escolares de 13 a 17 anos, e que 13,0% dos escolares de 13 a 17 anos já haviam usado alguma droga ilícita em algum momento da vida, como descrito na Figura 1. No Brasil o assunto é tratado como um fenômeno sociocultural, todavia as consequências deste evento são sentidas em outros setores da sociedade como saúde e segurança8. 23 Figura 1: Percentual de escolares de 13 a 17 anos que experimentaram drogas ilícitas alguma vez na vida, com indicação do intervalo de confiança de 95%, segundo as Unidades da Federação – 2019 Fonte: IBGE, Diretoria de Pesquisas, Coordenação de População e Indicadores Sociais, Pesquisa Nacional de Saúde do Escolar 2019 As substâncias químicas comumente usadas como drogas de abuso e que causam dependência psíquica e física podem ser classificadas em três grandes classes, de acordo com a sua principal ação no sistema nervoso central (SNC): (1) depressores do SNC, que são substâncias capazes de diminuir a atividade cerebral, também com propriedade analgésica. Pessoas sob o efeito dessas tornam-se sonolentas, lerdas, desatentas e desconcentradas. Entre as principais substâncias encontram-se opiáceos/opióides, etanol e barbitúricos; (2) estimulantes do SNC, que são substâncias capazes de aumentar a atividade cerebral. Elas aceleram a atividade de determinados sistemas neuronais, trazendo como consequências um estado de alerta exagerado, insônia e aceleração dos processos psíquicos. Citam-se, por exemplo, a cocaína ou crack, anfetaminas, metafetaminas (como MDMA) e anorexígenos; (3) perturbadores do SNC, que produzem uma série de distorções qualitativas no funcionamento do cérebro, como delírios, 24 alucinações e alteração na sensopercepção. Por essa razão, são também chamadas de alucinógenos. Como exemplo, temos o LSD, do inglês lysergic acid diethylamide, a psilocibina, a mescalina e os canabinóides8-12. A cocaína pertence ao grupo 2, sendo uma droga estimulante poderosamente viciante. A substância é derivada da planta Erythroxylon coca, o produto químico purificado, cloridrato de cocaína, foi isolado da planta há mais de 100 anos. Antes do desenvolvimento do anestésico local sintético, os cirurgiões usavam cocaína para bloquear a dor. No entanto, a pesquisa mostrou desde então que a cocaína é uma substância altamente viciante que pode alterar a estrutura e a função do cérebro se usada repetidamente13. A classificação da cocaína traz menção a um alcaloide tropânico com ação inibitória da recaptura de dopamina, serotonina e de noradrenalina prolongando a sensação de prazer. Esta é uma droga de elevada ação anestésica local, daí seu uso inicial na medicina, sendo um potente estimulante do sistema nervoso central13. A cocaína pertence à família dos alcaloides (compostos com nitrogênio aromático) que se obtém das folhas da planta de coca, a Erythroxylon coca, sendo relatada a alteração do conteúdo do alcaloide, segundo as regiões e as variedades distintas da planta. O arbusto é cultivado na América do Sul, em particular no Peru e na Bolívia, sendo encontrado ao leste dos Andes e acima da Bacia amazônica. Existem cerca de 200 espécies, mas apenas 17 delas são utilizadas para extração de cocaína. A cocaína pode ser consumida como sal, cloridrato de cocaína, ou na forma de base, o crack14. O funcionamento da droga se baseia na comunicação por neurotransmissores. Para pessoas sem efeitos de entorpecentes a dopamina é liberada por um neurônio na sinapse, no qual pode se ligar aos seus receptores em neurônios vizinhos. Em situação normal a dopamina é recapturada de volta para o neurônio transmissor por uma proteína especializada chamada transportador de dopamina. Quando na presença da cocaína, essa se liga ao transportador de dopamina e bloqueia o processo normal de recaptura, resultando no acúmulo de dopamina na sinapse, o que contribui para os efeitos prazerosos da cocaína14. Uma das formas mais rápidas de identificação inicial da classe de substâncias que compõe esses entorpecentes é a análise baseada no teste de Scott modificado (teste de triagem de laboratórios forenses), amplamente utilizado para identificar o cloridrato de cocaína, sendo criado por Scott em 1973 e modificado por Fasanello e Higgins para que pudesse ser aplicado para o crack. O teste de Scott, Equação 1, é realizado utilizando uma solução de tiocianato de cobalto II (Co(SCN)2) de coloração vermelha/rosácea em meio ácido, que na presença de cloridrato de cocaína, produz um complexo de cobalto II de coloração azul turquesa, aqui representado na Figura 215. 25 Figura 2: Reação negativa (à esquerda) e reação positiva (à direita) para a cocaína, mediante o uso do reagente de tiocianato de cobalto II Fonte: Revista Criminalística e Medicina Legal, 2016 Outra droga ilícita, no Brasil, comumente usada de forma recreativa cujo consumo vem crescendo é a maconha. Especialistas da área de saúde não aconselham o uso de maconha, todos desaprovam em virtude das evidências fisiológicas geradas pelo efeito do uso indiscriminado da droga. Há indicações suficientes de que ela pode ser considerada perigosa. Os perigos potenciais, para nossas mentes, são graves16. Como resultado, existe consenso esmagador de que esta droga não deve ser usada a esmo, e nenhum órgão médico responsável apoia tal ação17. No entanto, com a evolução das ciências já há produtos à base da planta que auxiliam no tratamento de doenças, tais como a esclerose múltipla e o autismo. 26 A Cannabis sativa L. (Linnaeus) é uma erva que pertence à família Cannabaceae sendo botanicamente catalogada em 1753 por Carl Von Linné18. Esta planta tem seus primeiros relatos na Ásia Central e na Ásia Ocidental sendo cultivada por mais de 4500 anos com diferentes propósitos. É visto, pois, que o avanço da ciência fez com que o cultivo de canabis abrangesse um mercado diversificado, de medicamentos a tecelagem, contudo dentre esses o fato desta planta ser utilizada como droga recreativa vem se tornando um incômodo para os órgãos governamentais. A partir dela, se obtém preparações ilícitas como a maconha, mundialmente conhecida como marijuana, o haxixe e o óleo de haxixe, que contêm compostos químicos denominados canabinoides, aos quais são atribuídas as propriedades psicotrópicas que classificam esses derivados como entorpecentes18. Por seu mecanismo de ação e seus feitos, a maconha é classificada como perturbadora do SNC, ou seja, pertence ao grupo 3 aqui já relatado. A responsável pelo efeito é a droga bruta, já que é derivada da planta canabis por tratar-se das flores e folhas secas desta. Ela é encontrada no mercado ilegal inalterada, bruta, prensada em tabletes e é comumente fumada. No Brasil, também se referem à planta canabis como maconha, palavra que em português acredita-se ser um anagrama da palavra cânhamo. A maconha é uma droga considerada ilícita em praticamente todo o mundo e a história relacionada à sua proibição é longa19. No Brasil, de acordo com a pesquisa do II Levantamento Nacional de Álcool e Drogas 2012 (II LENAD), a proporção de indivíduos que disse já ter utilizado maconha alguma vez na vida foi de 4,3% (597 mil pessoas) para adolescentes e 5,8% (7,8 milhões) para adultos. Também foi realizada uma análise para o consumo dessa droga nos doze meses do ano de 2012 e o resultado mostrou que 3,4% (478 mil) dos adolescentes e 2,5% (3,3 milhões) dos brasileiros adultos declararam ter utilizado maconha no período avaliado19. Sendo assim, a maconha, de acordo com profissionais da saúde, é uma droga perigosa, sem dúvidas, sendo seu risco mais comumente observado no seu poder de gerar uma espécie de dependência psicológica ao usuário. É visto pela medicina que tal droga não gera dependência química tão poderosa como outras drogas, em vez disso, a dependência psicológica é imputada20. Quanto à identificação de tal classe de substâncias, os canabinoides, os principais testes para caso de flagrante são, assim como no caso dos cloridratos, os colorimétricos, destacando o teste presuntivo de Duquenois-Levine e o Fast Blue B (sal duplo de cloreto de o-Dianisidinabis (diazotitizato) de zinco, (C14H12Cl2N4O2ZnCl2). A reação proposta para os canabinoides com o Fast Blue B ocorre por meio de acoplamento, isso promove o surgimento de cromóforos com a parte ativa da 27 substância de interesse forense. No teste colorimétrico com o Fast Blue B, a coloração amarelada inicialmente pode assumir três cores distintas em virtude da presença dos principais componentes de resposta, a coloração alaranjada para a presença de Canabidiol (CBD), lilás/púrpura para a presença de Canabinol (CBN) e avermelhada para a presença de Δ9-tetrahidrocanabinol (Δ9-THC), como representado pela Figura 322, valendo destacar que em amostras cotidianas é pouco provável a presença de apenas uma dessas substâncias, o que geralmente retorna uma cor castanho avermelhado para a resposta positiva de tal teste21. 28 Figura 3: Representação dos três principais canabinoides e suas colorações perante solução de Fast Blue B Fonte: DOS SANTOS, 2023 – Adaptada Um ponto digno de nota no estudo desta droga é a conversão do Δ9- tetrahidrocanabinol (Δ9-THC) em CBN. Isso ocorre porque a oxidação do Δ9-THC em canabinol (CBN) é um processo químico conhecido e bem compreendido, como a descarboxilação secundária, sendo importante destacar que o Δ9-THC é um composto psicoativo enquanto o CBN é um composto menos psicoativo. Esse processo de descarboxilação secundária ocorre quando o Δ9-THC é exposto a uma fonte de oxigênio e 29 calor prolongado, como luz e ar, processo que geralmente é comum quando usado como narcótico devido ao armazenamento e transporte23. Durante este processo, uma parte do grupo metilo (-CH3) é oxidada para formar aldeído, que é posteriormente hidrolisado para formar canabinol24. Embora o CBD seja – indiscutivelmente – atualmente o canabinóide mais conhecido, a conversão do CBD também pode potencialmente levar a outros produtos que podem causar efeitos psicotrópicos, que não foram examinados pela maioria dos estudos até agora. Outro ponto aqui discutido é a transformação do CBD em Δ9-THC em condições in vivo, aqui a provável transformação ocorre pela interação da hidroxila com a ligação pi presente por proximidade, o provável mecanismo segue a ruptura da ligação pi para a formação de uma estrutura heterocíclica, como mostrado por Δ9 – THC24. Essas conversões permitem classificar temporalmente as amostras expostas ao ambiente, o que ajuda a identificar a distância da produção em função do tempo de transporte e se uma amostra está há muito tempo nas ruas ou não. Vê-se, porém, que técnicas mais precisas, se comparadas à colorimetria tradicional, são necessárias na quantificação de tais substâncias25. A investigação química possui um ramo próprio, as ciências forenses que se baseiam no conceito de que não pode haver crime sem alguma prova, ou seja, não há transgressão sem o aparecimento de vestígio que, após a devida análise, tenha sido verificado, tecnicamente e cientificamente, sua relação com o fato investigado. Vale destacar outro caminho que suporta a necessidade de tecnologias na área, as descobertas de medicamentos com canabinoides como princípio ativo que podem ser usados em diversas situações, tais como: profilaxia da náusea induzida por quimioterapia, estímulo de apetite em doentes com SIDA (Síndrome de Imunodeficiência Adquirida), controle de espasmos em esclerose múltipla, e outros. A lei n.º 33/2018 de 18 de julho estabelece o quadro legal para a utilização de preparações e substâncias à base da planta da canabis, sendo reservada apenas quando os tratamentos convencionais não apresentam os efeitos esperados ou provocam efeitos adversos relevantes26. Casos como o Alzheimer, uma patologia crônica progressiva e degenerativa, têm mostrado o potencial da planta canabis no retardo de seus efeitos progressivos. Os estudos apontam que os canabinoides possuem potencial terapêutico em pacientes acometidos com a doença, retardando a neurodegeneração e promovendo a criação de novos neurônios. Vale destacar que o princípio ativo mais estudado na planta com importância medicinal é o canabidiol, por não ser psicoativo, o qual atua em diversos sistemas de receptores sem apresentar efeitos adversos tóxicos. Assim, outras patologias estão sendo 30 estudadas como: a epilepsia e o glaucoma, sendo que já há algumas formas farmacêuticas disponíveis para uso, comercializadas países como Canadá, Holanda, Alemanha, Portugal, Itália, Finlândia e nos Estados Unidos da América sendo necessário assim uma fiscalização mais rígida para controle da qualidade e do uso27,28. Vale destacar que a pesquisa sobre análises de entorpecentes tem aumentado em demasia, principalmente se for rápida, barata e in situ, como o caso de ações colorimétricas, a fim de controlar tal problema e ajudar a solver doenças irremediáveis até o momento. Uma rápida pesquisa em bancos de dados com a expressão chave “drugs and colorimetry” retorna que dos 406 artigos expostos sobre o assunto, 172 estão diretamente ligados à Química, sendo 87 direcionados especificamente à Química Analítica. A Figura 4 por outro lado nos informa os resultados mediante as datas de publicação do assunto referido, demonstrando aumento significativo para o presente assunto apresentado. Figura 4: Resultado da Web of Science por ano de publicação para a combinação das palavras “Drugs and Colorimetry” Fonte: Web of Science, 2022 É visto ainda que drogas aqui citadas acabam sendo eliminadas pela urina ou metabolizadas, isso abre precedente para uma prática de análise de fluidos corporais, uma vez que o solvente presente nesses fluidos também é polar. HORNING et al. discutiram análises multicomponentes para alguns constituintes urinários: esteróides, ácidos, drogas e metabolitos de drogas. Os métodos foram baseados em técnicas analíticas em fase gasosa, que incluem o uso de onerosos equipamentos laboratoriais como cromatógrafo em fase gasosa - espectrometria de massa. Após o isolamento da amostra preparam derivados em cada instância. A cromatografia gasosa foi utilizada para separações, enquanto a 31 espectrometria de massa para identificação29. Contudo, a única forma de confirma substâncias e avaliar o seu potencial bioquímico é com pesquisa e desenvolvimento na área de investigação correspondente, assim surge as ciências forense, uma parte da química responsável por identificar e classificar substâncias e situações, ou seja, responsável por investigar. 1.2 As Ciências Forense As ciências forenses baseiam-se no conceito de que não pode haver crime sem alguma evidência, ou seja, não há transgressão sem o surgimento de um vestígio que, após as devidas análises, tenha constatada, técnica e cientificamente, sua relação com o fato periciado, como um fragmento mínimo de célula da pele, fibras microscópicas, ou o mínimo de resquício de um veneno presente em uma gota de sangue. A evolução das ciências forenses tem sido proporcional ao desenvolvimento de instrumentos sofisticados, cada vez mais precisos e sensíveis, tendo seu destaque inicial no século XIX uma vez que anteriormente o desenvolvimento das ciências como a química, biologia, física e medicina era mínimo30. Mais especificamente, a química forense é trazida como um ramo das ciências forenses voltado para a produção de provas materiais para a justiça, através da análise de substâncias em diversas matrizes, tais como drogas lícitas e ilícitas, venenos, acelerantes e resíduos de incêndio, explosivos, resíduos de disparo de armas de fogo, combustíveis, tintas e fibras31. Ou seja, a química forense busca o desenvolvimento de metodologias que produzam evidências materiais por meio da análise de drogas e amostras coletadas em cenas de crimes com o objetivo de explicar e formar provas válidas sobre determinado assunto. Essas novas tecnologias permitem uma comprovação eficiente de crimes por análises em laboratório, porém a possibilidade de confirmação de amostras in loco poderia solver mais rapidamente diversos problemas além de propiciar outro ponto de vista pelo imediatismo da situação32. O desenvolvimento químico brasileiro se iniciou após a consolidação da medicina, isso pois esta buscou investigações criminais a partir de agentes tóxicos e foi tendo sua aplicação ampliada e diversificada dentro da criminalística, sendo consolidada como a química forense33. Uma das técnicas mais usadas nas ciências forense é a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), do inglês High Performance Liquid Chromatography (HPLC), uma das ferramentas mais resolutivas em química analítica devido à sua capacidade de separar/isolar substâncias presentes em matrizes complexas. A técnica é capaz de separar 32 compostos que estejam presentes em praticamente qualquer amostra que possa ser dissolvida em um líquido. O método se utiliza do princípio de que uma solução de amostra é injetada em uma coluna com auxílio de uma bomba de pressão, essa coluna é feita de um material poroso, chamada de fase estacionária, e um líquido, denominado de fase móvel, que é bombeado a alta pressão. As substâncias são separadas com base nas diferentes relações de polaridade/interações intermoleculares entre a fase móvel, analito e fase estacionária. Dependendo do comportamento da partição de diferentes componentes, ocorre a eluição em tempos diferentes34. Dentro da amostra os analitos com maior afinidade com a fase estacionária irá viajar mais lentamente e deslocará uma distância menor dentro da coluna em comparação a analitos de menor afinidade à parede interna da coluna, sendo assim esses chegam primeiro ao detector em detrimento daqueles de maior afinidade à substância impregnada na coluna. A cromatografia líquida de alta eficiência é versátil pois: não se limita a amostras voláteis e termicamente estáveis, e a escolha de fases móveis e estacionárias é mais ampla. Vale destacar que o método apresenta inúmeras vantagens analíticas, tais como: análise simultânea de mais de uma substância, alta resolução, alta sensibilidade, boa repetibilidade, baixa quantidade amostral, condição de análise moderada, fácil de fracionar a amostra e de purificar35. No entanto, há parâmetros cromatográficos que devem ser avaliados e controlados para manter a eficiência da técnica, o que torna o método um tanto quanto oneroso para uma prática rotineira. A fase móvel, a coluna, a temperatura da coluna, a pressão e o gradiente apropriados devem ser encontrados para proporcionar compatibilidade e estabilidade adequadas dos analitos, bem como degradantes e impurezas. É visto, pois, que é uma técnica valiosa para análises exploratórias e pode ser usada como contraprova de análises mais baratas e rápidas36. Outra técnica recorrente nas ciências forenses é a Espectrometria de Massas, esta permite investigar a estruturação espacial das moléculas. A combinação da especialização molecular com análise local produz uma resposta de estrutura molecular de alta resolução. A detecção bem-sucedida dos analitos de interesse na resolução espacial desejada requer atenção cuidadosa a várias etapas no protocolo de imagem de espectrometria de massa37. A técnica da espectrometria de massas tem por fim detectar e identificar moléculas pesquisadas por meio da medição da relação sinal/carga dos fragmentos gerados na ionização por ação elétrica. Sendo assim, o princípio físico primordial do método consiste em gerar íons moleculares por uma técnica adequada, separá-los de acordo com a sua 33 relação de massa/carga (m/z) e assim detectá-los em nível qualitativo e quantitativo haja visto sua respectiva taxa m/z e abundância como pode ser visto na Figura 538. Figura 5: Esquema de análise em espectrômetro de massas Fonte: MIRANDA, 2019 Dessa forma, a técnica permite: identificar compostos desconhecidos, quantificar compostos conhecidos, elucidar as propriedades químicas e estruturais de uma molécula, medir a massa molecular de alguns compostos, além de determinar modificações pós- traducionais de proteínas39. A evolução científica proporcionou aumento no número de produtos e assim a necessidade de seu controle exigiu o desenvolvimento de técnicas analíticas mais confiáveis, eficazes, rápidas e de preferência in situ. Um programa de controle propicia vantagem competitiva já que é possível se resguardar de eventuais problemas que possam gerar riscos para a empresa. Nesta visão, imagens digitais oferecem a oportunidade de métodos analíticos simples, rápidos, não destrutivos e de baixo custo quando comparadas a técnicas analíticas tradicionais, sendo, portanto, uma poderosa fonte de dados analíticos. Vale destacar, que o sistema mais utilizado para imagens coloridas é a associação das cores vermelho, verde e azul do inglês RGB (Red, Green and Blue)40. O sistema RGB se baseia na organização de matriz construída por linhas e colunas, onde os índices determinam um ponto na imagem, esses pontos são definidos como “elementos de imagem” ou simplesmente pixel. Dessa forma, cada pixel é construído por uma intensidade de cores no sistema RGB, ou seja, há um valor de resposta para cada uma das três cores do RGB que quando associados propiciam diferentes cores. Assim, a relação entre sistemas de cor RGB e ensaios colorimétricos permitem a obtenção de dados qualitativos e medições analíticas quantitativas40. Contudo, a geração dessa imagem e sua 34 conversão para um método de análise é um pouco mais complicado, haja visto o elevado número de dados gerados. 1.3 Gerando a imagem digital A imagem é um recurso humano desde os primórdios do surgimento da sociedade, é usada para a transmissão de informações, cultura, perigo, linguagens e diversos. As pinturas rupestres, que tratam de representações artísticas encontradas no interior de cavernas pré-históricas são datadas como as mais antigas, mas seus registros permeiam toda a história humana41. A palavra imagem tem sua origem no latim imago que numa tradução direta remete a figura, sombra e representação. Sendo assim, pode-se relatar que a imagem é uma relação entre a luz e a matéria a ela aplicada. Por ser um meio de comunicação e informação, as imagens estão presentes em várias áreas do conhecimento, possuindo definições específicas de acordo com cada esfera42. Com o advento da primeira câmera portátil em 1888 surgiu um novo mercado competitivo tecnológico, sendo assim os investimentos nesta área subiram com o intuito de desenvolver câmeras cada vez mais práticas e com imagens de qualidade superior para suprir as exigências da sociedade consumista. A primeira imagem digital foi registrada em 1957 por Russell Kirsch, que foi produzida com 176x176 pixels, em preto e branco, em um computador por meio de um scanner de mesa42. A necessidade humana de passar sua história aliada ao seu narcisismo viu nas imagens digitais uma ótima oportunidade, o que abriu caminho para popularização e com consequente necessidade de avanços tecnológicos na área. O impulso tecnológico levou à incorporação de tal tecnologia aos telefones portáteis na construção dos conhecidos smartphones, demasiadamente utilizados atualmente, e em constante processo de aperfeiçoamento e atualização das necessidades humanas. A definição atual de imagem permeia com recursos mais tecnológicos, essa se estrutura bidimensionalmente pela intensidade da luz refletida ou emitida por uma cena gerada de aparelhos eletrônicos equipados com os chamados dispositivos de carga acoplada, do inglês Charge-Coupled Device (CCD). Nestes sensores, cada pixel alvejado pela luz guarda a cor e a intensidade, assim o sensor recebe a informação advindo de cada fileira de fotodiodos, amplifica o sinal e é convertido pelo conversor analógico-digital. Vale destacar a maior sensibilidade a 35 luminosidade por parte deste modelo de sensor, mas consome mais energia e tem maior custo de confecção43. Outro modelo de sensor são os semicondutores de metal óxido complementar, do inglês Complementary Metal Oxide Semiconductor (CMOS). Este tipo é o mais comum na construção dos smartphones, câmeras e webcams, uma vez que a captura das cores de cada pixel é revestida pelo filtro vermelho, verde ou azul, tornando o processo mais barato com alta eficiência. Na captura da imagem, parte da energia é absorvida, transmitida e refletida, sendo que a luz refletida é transformada em energia elétrica, pelos detectores, facilitando a transformação da imagem para dados matriciais44. Como já descrito, cada pixel traz a informação da intensidade luminosa de três comprimentos de onda, o sistema RGB. Estas cores ao serem combinadas propiciam ao usuário o alcance, a partir do dispositivo, a diferentes tipos de cores como é mostrado na Figura 6. As cores do sistema RGB são formadas por meio de uma escala que varia de 0 – 255, sendo que há formação da coloração branca, haja visto o disco de Newton, quando todas as cores estão no máximo (255, 255, 255), Figura 645. 36 Figura 6: Composição de cores do sistema RGB e suas intensidades. Fonte: Gonzalez e Woods, 2007 – Adaptada. O sistema RGB se estrutura na construção de matriz para cada pixel, como a imagem é construída por pixels em uma área, a matriz final é um arranjo segundo a matemática. Isso permite que a imagem seja representada tendo a sensibilidade como resposta em coordenadas cartesianas. Sua construção, como já demonstrado, se apresenta inicialmente com cores primárias (vermelho, verde e azul), além das secundárias (magenta, ciano e amarelo), do preto e do branco. Em suma, o sistema RGB é um modelo em que as cores vermelho, verde e azul se misturam para gerar uma ampla gama de cores. É imprescindível destacar, que fatores como iluminação, distância entre o objeto e a lente da câmera e linearidade dos sensores influenciam nos resultados, principalmente quantitativos, obtidos nas análises de imagem digital46. Por motivos como o já destacado, em especial, a evolução do registro da imagem, capacidade de armazenamento e fatores 37 externos que a pesquisa sobre o sistema RGB só vem aumentando. Uma pesquisa rápida na base de dados da Web of Science com a expressão “RGB System” gera um total de 12737 artigos publicados até o momento. Pode-se inferir um total de 606 artigos ao se observar aqueles referentes apenas à Química Analítica, o que representa cerca de 5% de todos os artigos publicados sobre o assunto. Sendo importante relatar o aumento significativo de publicações com o passar dos anos, uma vez que a tecnologia associada foi evoluindo permitindo a correlação matemática necessária para a confiabilidade necessária, isso pode ser inferido com base na Figura 7. Contudo, ainda há o desafio de integrar essa tecnologia que envolve um número ilimitado de dados à análise in situ, necessitando de um computador para tal solução, ou seja, um computador de bolso. Figura 7: Resultado da Web of Science por ano de publicação apenas para a Química para a expressão “RGB System” Fonte: Web of Science, 2022 1.4 O uso de smartphones na química Com o advento de novas tecnologias a vertente da fotografia digital também teve seu complemento, tanto em questão de software quanto de hardware, possibilitando sua integração ao dia a dia, os chamados aplicativos. É importante destacar que seu uso para a analítica se iniciou pela correlação com a Lei de Lambert-Beer, vale lembrar que tradicionalmente análises que envolvam analitos cromóforos ou que surjam por reação são determinados por meio da espectroscopia. Esses equipamentos trabalham com fonte contínua de radiação além de um monocromador, que restringe comprimentos de onda, a 38 cubeta (armazenamento da amostra/padrões) e dispositivos capazes realizar a detecção dos sinais, ou seja, um detector. Logo, o detector registra o sinal elétrico que corresponde à diferença de energia entre o estado menos energético (fundamental) para um de maior energia (excitado), ou seja, a energia correspondida à transição eletrônica. Essa energia absorvida pela molécula é diretamente proporcional à concentração do analito de interesse na amostra, sendo assim possível de quantificá-lo47. Os equipamentos usados na prática discutida aqui correlacionam a transmitância, a fração da energia luminosa que consegue atravessar uma determinada espessura de um material, sem ser absorvida, com o comprimento de onda apresentando um espectro de absorção. Essa relação de proporcionalidade deve-se à Lei de Lambert-Beer, esta afere a medição da absorbância (A) ou transmitância (T) do analito dentro de um caminho óptico (b – em cm). A transmitância é medida pela relação entre a potência do feixe da radiação incidente (P0) pela potência da radiação após (P) a corrida de todo caminho óptico contendo o analito de interesse. Assim, a Lei de Lambert-Beer pode ser resumida da seguinte forma: 𝐴 = − log 𝑇 Eq. 2 𝐴 = 𝜀 × 𝑏 × 𝑐 Eq. 3 Onde: Ɛ: absortividade molar (característica de cada espécie absorvente) T: P/P0 b: caminho óptico c: concentração Lambert percebeu que independentemente da intensidade luminosa que atingia a cubeta, no exato momento em que o feixe de luz monocromática era incidido no meio transparente, este absorvia uma fração igual de luz, em cada camada, que por esse meio passava. A luz monocromática difratada por um prisma ao passar por uma fenda e refletida por espelhos ou uma grade de difração até o orifício de saída (monocromador ou filtros), é direcionada para percorrer através de uma cubeta (amostra). Essa luz, com menor energia, haja visto a absorção dos analitos, chega ao detector (células fotovoltaicas, fototubos, tubos fotomultiplicadores, fotocondutividade, fotodiodos de silício e transferência de carga) e diferença energética é usada para determinar o comprimento de onda com base na teoria de Lambert-Beer. O espectro específico da amostra é gerado a partir da porção da radiação 39 que não é absorvida pela amostra que ao atingir o detector transforma a decodificação da energia luminosa em diversos comprimentos de onda48. Como discutido então, a teoria diz respeito a relação entre a transmissão de luz e a espessura da camada do meio absorvente e a intensidade da luz observada. Quando um feixe de luz monocromática, um único comprimento de onda, passava através de um meio translúcido homogêneo, a absorção da luz era proporcionalmente homogênea, não sendo dependente da quantia de luz. Isso permitiu correlacionar diretamente a concentração de uma solução com sua quantidade de luz absorvida. Assim, é importante destacar que a relação entre imagem digital e ensaios colorimétricos favorece a obtenção de dados qualitativos e medições analíticas quantitativas48. O baixo custo aliado à resposta imediata faz com que a obtenção de dados por práticas analíticas baseadas em colorimetria ganhem destaque em diversas áreas, tais como alimentar, bebidas, combustíveis e mais recentemente em drogas. Em aeroportos, para avaliar a presença de entorpecentes, por exemplo, testes são realizados visualmente, isto é, a olho humano, onde o uso de imagem digital poderia minimiza a subjetividade recorrente nesses tipos de análises. Aplicativos de análise para imagem digital já estão nos bancos de dados, tem-se o exemplo do RedGim, outro recorrente é o Photometrix®, que tem como objetivo avaliar o processamento de imagens na quantificação de substâncias químicas utilizando ferramentas quimiométricas associadas. Este aplicativo foi desenvolvido pelo professor Gilson A. Helfer e colaboradores na Universidade de Santa Cruz do Sul no Rio Grande do Sul46, sendo sua interface de fácil manejo como demonstra a Figura 846. 40 Figura 8: Interface do aplicativo Photometrix para smartphones Fonte: Helfer, G. A. et al., 2016 – Adaptada O uso de tal aplicativo em técnicas colorimétricas com base em papel não está tão disseminado ainda, mesmo sendo uma prática barata e rápida, uma vez que a colorimetria é dependente da especificidade de cada substância, sendo difícil o uso para matrizes mais complexas. No entanto, uma técnica, a microfluídica, vem permitindo o uso de colorimetria mesmo em matrizes de maior complexidade dada a sua pequena região de análise, principalmente. 1.5 Microfluídica A microfluídica, de forma geral, é o estudo do comportamento atribuído a pequenas amostras de fluido em pequenos canais. A aplicação de tal técnica está diretamente ligada a exames bioquímicos e farmacêuticos, bem como à medicina moderna. Todavia, existem algumas definições mais elaboradas que contemplam uma variedade de fatores ocultados neste conceito. Uma das mais discutidas define a microfluídica como a ciência e a tecnologia de sistemas que manipulam e estudam pequenas quantidades de fluidos, 41 utilizando estruturas com dimensões de dezenas a centenas de micrômetros (microdispositivos)48,49. A microfluídica está se tornando mais presente em novos equipamentos utilizados na indústria química, e por consequência nas ciências forenses, isso, pois gera uma maior economia de reagentes e menores custos de operação. Tal tendência se deve pela crescente miniaturização de dispositivos eletrônicos. A miniaturização teve início na década de 60, quando dispositivos analógicos começaram a ser substituídos por digitais, que, por sua vez, tem dimensões menores e eficiência equivalente – Figura 949. Figura 9: Microcontrolador digital Fonte: Grupo Autcomp, 2022 A miniaturização da eletrônica pode ser notada facilmente ao se comparar uma televisão da década de 70 com uma televisão atual, ou mesmo ao se comparar um notebook aos primeiros desktops50. Na década de 90, Manz et al. propuseram o conceito de microssistemas para análises totais do inglês micro total analysis system, ou simplesmente µTAS. Com o desenvolvimento dos µTAS, tornou-se possível integrar várias etapas analíticas, como introdução da amostra, pré-tratamento da amostra, reações químicas, separação analítica e detecção em um único dispositivo51,52. Devido à ideia de inserir várias etapas, normalmente desenvolvidas em um laboratório, em um chip, os µTAS são também denominados “lab-on-chip” (LOC – Figura 10)53. Os µTAS, ou LOC, transformam 42 informações químicas em sinais elétricos ou ópticos, possibilitando uma fácil automação. Estes aspectos se tornaram relevantes para o campo clínico e ambiental em que o termo “point-of-care” vem sendo utilizado50-52. Todos estes fatores, aliados à portabilidade, impulsionaram o desenvolvimento explosivo e maciço dos sistemas analíticos em microescala nos últimos anos52. Figura 10: Microdispositivo sofisticado com processador (LOC) Fonte: NEWS – Medical Life Sciences, 2019 Já em meados da primeira década do século XXI outro aparelho inovador modificou e acelerou o rumo dos microdispositivos, a impressora 3D. As impressoras que imprimem tridimensionalmente utilizam uma resina, que enrijece quando na presença de luz ultravioleta, para produzir uma escultura perfeitamente alinhada com as determinações inseridas em programas computacionais específicos para tais equipamentos. É possível criar, por exemplo, um sistema de canais virtualmente, com medidas micrométricas e imprimir tal estrutura sem grandes dificuldades54. Novos métodos que utilizam da microfluídica como meio de análise surgem proporcionalmente à popularização desta técnica. Destacam-se entre as inovações os 43 microdispositivos a base de papel, que possuem baixo custo de fabricação e podem ser utilizados de forma portátil. 1.5.1 Microfluidic Paper-Based Analytical Devices (μPADs) Os dispositivos microfluídicos a base de papel (μPADs, do inglês microfluidic paper- based analytical devices) foram criados pelo grupo de pesquisa liderado pelo professor George Whitesides na Universidade de Harvard – Figura 1150 – para serem utilizados como sensores colorimétricos em análises biológicas de baixo custo. O papel é composto majoritariamente por um polímero de celulose, motivo que o torna poroso, favorecendo a microfluidez de líquidos por entre as fibras devido ao processo de capilaridade55. Figura 11: Microdispositivo a base de papel Fonte: Biomicrofluidics, 2012 Há vantagens da utilização de papel, podendo-se listar: a grande abundância, baixo custo comparado com outras plataformas para sensoriamento, fácil obtenção e manuseio, compatibilidade com produções em larga escala de dispositivos microfluídicos, possibilidade de armazenamento em longo prazo, fácil modificação física e química de sua superfície para bio-ensaios, fácil descarte através de incineração tornando-o mais ambientalmente correto, possibilidade de utilização de volumes reduzidos de amostras (micro a nanolitros dependendo da resolução das barreiras criadas no papel), coloração branca (adequada para testes colorimétricos), dentre outras. Todavia, alguns fatores também podem dificultar a utilização de tal matriz, como a sensibilidade à umidade e a homogeneidade de sua estrutura56. 44 Ao utilizar μPADs para análises colorimétricas há ganhos listados tal como à portabilidade, acessibilidade e simplicidade dos dispositivos. Porém, sua aplicabilidade nem sempre pode ser realizada de forma direta, havendo necessidade de um tratamento prévio da amostra para evitar interferências da cor da solução, inconsistências em iluminação, falta de uniformidade, ou a presença de contaminantes particulados que podem confundir a interpretação do resultado colorimétrico. É possível acoplar esses processos de pré- tratamento em um único dispositivo descartável em papel. Tanto que o número de publicações sobre o assunto está crescendo gradativamente com o passar dos anos, as publicações surgem de variados campos de pesquisa. Das 1236 publicações com a chave de busca “microfluidic paper-based analytical devices“ 817 são direcionadas à Química Analítica, mas pode-se ver artigos relacionados à qualidade de alimentos, à biofísica, à medicina e outros. Como já relatado o número de publicações tem aumentado sendo apresentado na Figura 12. Figura 12: Resultado da Web of Science por ano de publicação para a expressão “microfluidic paper-based analytical devices” Fonte: Web of Science, 2022 Dentre as formas de se produzir μPADs destaca-se a deposição de cera utilizando impressoras de tinta sólida, técnica conhecida como wax printing. Após a impressão, é necessário aquecer o papel até o ponto de fusão da cera para que ela penetre por entre as fibras de celulose. O aquecimento pode ser promovido por uma placa de aquecimento, equipamento comum em laboratórios. A utilização de μPADs como sensores colorimétricos já é ampla na literatura científica. Monitoramento de titulações ácido-base, análises de alimentos, análises forenses – Figura 1315 – determinação de metais, compostos 45 explosivos e biomarcadores tumorais são exemplos da amplitude da aplicação desta técnica57-60. Figura 13: Microdispositivo a base de papel para análise forense Fonte: Revista Criminalística e Medicina Legal, 2016 É visto, pois, que a imagem digital eleva o número de possibilidade analíticas, mas com isso se eleva também o número de dados obtidos, dificultando que análises univariadas sejam capazes de gerar os resultados esperados. Para solver tal situação a análise multivariada é o melhor suporte. A análise multivariada de imagem (do inglês Multivariate Image Analysis - MIA) se iniciou em meados da década de 80 a fim de usar toda a extensão das informações de uma imagem colorida. Assim, o uso da MIA permite trabalhar com os três canais do sistema RGB ou ainda uma série de imagens multiespectrais, tornando a resposta elétrica mais fidedigna ao valor colorimétrico exato61. A MIA trata os pixels de forma individual, constrói uma matriz de dados com base nas linhas e nas colunas, como já relatado, uma matriz tridimensional é construída já que cada pixel da imagem tem três respostas de sinal, o sistema RGB. Assim, a região de estudo que apresenta as informações contidas na imagem é representada pelo histograma de cores62. Com o advento da análise multivariada sua busca para solver diversos problemas antes estudados univariadamente só aumentou, uma vez que agora enigmas antes limitados ou restringidos podem agora ser avaliados como realmente são, a Tabela 1 representa um pouco da pesquisa relacionada à analise multivariada de dados, sendo apresentados apenas os artigos que citam o aplicativo Photometrix® como base para análise, ou seja, que trabalham com imagens assim como este trabalho, o que aumenta a necessidade de pesquisa acerca do assunto. 46 Tabela 1: Levantamento bibliográfico referente aos artigos publicados utilizando como palavra-chave "Photometrix" na base de dados Web of Science. Ano Matriz estudada Análise Dados analíticos Ref. 2016 Taninos PCA - Grasel et al.,,., 201663 2017 Suplemento vitamínico e cédulas Exp. 1: Univariada (curva calibração - canal H) Exp. 2: PCA Exp. 1: R = 0,999 y = 2,552x + 127,626 LD = 0,19 mg/L LQ = 0,23 mg/L RMSD = 0,37 mg MRE = 1,04% Exp. 2: Variância = 98,65% PC1 = 76,14% (R$ 100 score negativo) PC2 = 17,14% (R$20 score positivo e R$50 score negativo) PC1 = difere cédulas brasileiras (R, G, V, L) das argentinas Helfer et al.,,., 201746 2017 Ácido acético em vinagre Univariada (curva calibração) R = 0,99 CV = <8% Nogueira et al.,,., 201764 2017 Iodo em biodiesel Univariada (curva calibração) R = 0,98 LD = 8g / 100 g biodiesel CV = 4,9% (n = 10) Soares et al.,, 201765 2018 Estabilidade leite cru PLS (curva calibração) R = 0,9917 RMSEC = 0,261 RMSEP = 0,301 CV = <5% Helfer et al.,,., 201866 2018 Etanol de cana de açúcar PLS (curva calibração) R = 0,9963 LD = 0,19 % v/v LQ = 0,62% v/v CV = <4% RSD = <0,5% RMSEC = 0,1073% v/v RMSEP = 0,0677% v/v Bock et al.,,., 201867 2018 Cera em fritura PCA R = 0,9095 LD = 2,14% RSD <3% Yulia et al.,,., 201868 2019 Proteína em soro humano Univariada (curva calibração) Albumina: R = 0,984; LD = 0,6 ug; LQ = 1,9 ug IgG: R = 0,980; LD = 0,7; LQ = 2,0 Anidrase carbônica: R = 0,989; LD = 0,7; LQ = 2,4 De Jesus et al.,,., 201969 2019 Lactase em formulações farmacêuticas Univariada (curva calibração) R = 0,986 y = 119.82x + 91.67 Faixa de linearidade = 0 – 0,38 mg LD = 0,0006 mg Dionizio et al.,,., 201970 47 LQ = 0,002 mg RSD = 3 - 13% 2019 Ferro total dissolvido e peróxido de hidrogênio em água PLS (curva calibração) Ferro total dissolvido ISSO 6332 modificado: R = 0,9999 a = 0,0073 b = 0,020 LD = 0,15 mg/L LQ = 0,50 mg/L RSD <10% Especiação de ferro (hidroquinona): R = 0,9999 LD = 0,029 LQ = 0,097 RSD <7% Peróxido de hidrogênio (calibração de baixo alcance) R = 0,9999 LD = 0,72 mg/L LQ = 2,40 mg/L RSD <8% Peróxido de hidrogênio (calibração de alto alcance) R = 0,9999 LD = 0,72 mg/L LQ = 2,40 mg/L RSD 58% Lumbaque et al.,,., 201971 2019 Cromo em couro Univariada (curva de calibração) R = 0,9993 LD = 0,6 mg/kg LD = 2 mg/kg RSD = 7,5% Costa et al.,,., 201972 2019 Metanol em biodiesel Univariada (curva de calibração) R = 0,964 LD = 90 mg/kg CV = 3,7% Soares e Rocha, 201973 2019 Metanol em biodiesel Univariada (curva de calibração) R = 0,990 (600uL de extrato da amostra) e 0,994 (150 uL de extrato da amostra) LD = 10 mg/kg (1/4) CV = 4,8% (1/4) Soares et al.,,., 201974 2019 Flúor e Fósforo em água Univariada (curva calibração) Fósforo: R = 0,999 y = 414,602x + 1,638 LD = 0,010 mg/L LQ = 0,019 mg/L Flúor: R = 0,998 y = 35,813x – 1,585 LD = 0,05 mg/L LQ = 0,10 mg/L Pappis et al.,,., 201975 2020 Biodiesel em amostras de diesel Univariada (curva calibração) R = 0,999 G = 59,4 + 1,7C CV = 0,9% (n=10) LD = 1,0% v/v Soares et al.,,., 202076 48 2020 Notas de dinheiro brasileiro (Real) PCA R$100: PC1 anverso e reverso (canais R e G) e variância de 97,40 – 99,15%. R$20: PC2 autênticas e falsificadas (autênticas: canais G e H anverso e G, B e H reverso com variância de 90,27% e 92,3%, respectivamente). R$10: PC2 anverso (canais G. B e H) e PC1 reverso (canal H) com variância de 94,33 – 95,62% Vittorazzi et al.,,., 202077 2020 H2O2, NaClO e amido em leite PLS (curva calibração) Photometrix: H2O2: R = 0,999 y = 1,000x + 0,000 RMSEC = 0,0083 RMSECV = 0,313 NaClO: R = 0,993 y = 0,993x + 0,041 RMSEC = 0,5087 RMSECV = 5,462 Amido: R = 0,997 y = 0,997x + 0,014 RMSECV = 4,163 Redgim: H2O2: R = 0,979 y = 0,9584x + 0,0187 RMSEC = 0,0104 NaClO: R = 0,965 y = 0,945x + 0,2289 RMSEC = 0,095 Amido: R = 0,978 y = 0,9257x + 0,1278 RMSECV = 1,1 Costa et al.,,., 202078 2020 Ésteres em cachaça cana de açúcar Univariada (curva calibração) R = 0,990 y = 79,9 + 0,148C CV = 1,1% (n = 10) LD = 30 mg/L Soares et al.,,., 202079 2020 Fenóis totais e antioxidantes em tomate, morango e café Univariada (curva calibração) Faixa de linearidade = 0 – 31,8 mg/L (quercetina) e 0 – 5 mg/L (2,6-di-tert-butil- 4-metilpenol) R = 0,9995 LD = 0,03 mg/L (quercetina) e 0,26 mg/L (2,6-di-tert-butil- 4-metilpenol) LQ = 0,11 mg/L (quercetina) e 0,88 mg/L (2,6-di-tert-butil- 4-metilpenol) Recuperação: 96,48 – 101,11% (quercetina) e 99,00 – 106,00% (2,6- Bazani et al.,,., 202080 49 di-tert-butil-4- metilpenol) 2021 Cromo 3+ em suplemento alimentar Univariada (curva calibração) R² = 0,9878 y = 32,387x + 12,762 Faixa linear = 2,0 – 5,0 mg/L LD = 1,52 mg/L Sangsin et al.,,., 202181 2021 Ácido úrico em saliva Univariada (curva calibração) R = 0,999 y = 83,9 + 0,77C Faixa linear = 25 e 150 umol/L CV = 1,4% LD = 8 um mol/L Soares et al.,,., 202182 2022 Notas de dinheiro brasileiro (Real) PCA e HCA Variâncias explicativas foram obtidas de 97,2 a 98,64; 89,75 a 96,15 e 72,5 a 86,37%, respectivamente, para as cédulas de R$ 100, R$ 50 e R$ 20. Costa et al.,,., 202283 2022 Soluções de diferentes pH PLS RMSEC de 0.79, RMSECV de 0.82 Viés de Validação cruzada de 1,5 × 103, R2 de 0.97 e validação Cruzada de 0.97 e erro mínimo de 0.98. Barboza et al.,,., 202284 1.6 Quimiometria aplicada O uso de ferramentas quimiométricas vem revolucionando a analítica, em especial no direcionamento forense. Vale destacar que a Quimiometria permite avaliar o número elevado de dados pós análise, mas também auxilia na construção mais controlada desses. Uma das ferramentas mais importantes no atual desenvolvimento de métodos analíticos é o planejamento de experimentos, do inglês Design of Experiment (DOE). Essa possibilita uma melhor estimativa da variabilidade de resultados, redução de tempos de análises além da redução dos custos envolvidos85. Aplicações rotineiras de métodos quimiométricos afluem da literatura em química analítica, sendo de grande valia, por exemplo, em métodos de extração, uma vez que há vários fatores influentes neste processo86. O planejamento experimental não visa buscar apenas a simples descrição do experimento, mas sim explicitar a inferência sobre as causas do processo e/ou as relações das condições. Isso permite inferir sobre o que produziu ou contribuiu para tais eventos, sempre buscando as melhores condições para a realização do experimento, como observado na Figura 1415. Vale destacar a existência de variadas abordagens que podem ser empregadas durante o planejamento experimental, sendo que a escolha é determinada de acordo com a necessidade da avaliação. Dessa forma um planejamento pode ser 50 executado usando-se o modelo fatorial, o fatorial fracionário, o Doehlert, o composto central (Central Composite Design - CCD), o Box-Behnken (Box-Behnken Design - BBD), entre outros87. Figura 14: Superfície de resposta com a desejabilidade em função do diâmetro e da porcentagem de tiocianato Fonte: REIS, 2022 Em relação às ferramentas de análise, a Análise de Componentes Principais, do inglês Principal Component Analysis (PCA) é a técnica quimiométrica de maior destaque e amplamente consolidada em química analítica. Assim, a PCA, uma poderosa técnica de reconhecimento de padrões sem supervisão, foi empregada neste trabalho para permitir a identificação de formação de clusters, possibilitando a detecção de amostras anômalas88. Além disso, pode ser considerada a base para inúmeros processos de classificação, reconhecimento de padrões e calibração multivariada89. A PCA é um dos métodos de destaque apreciável na Quimiometria, sendo esse procedimento a base para inúmeros processos de classificação – Figura 1515 – reconhecimento de padrões e calibração multivariada89. A PCA é uma técnica de análise multivariada, ou seja, avalia diversos caminhos ao mesmo tempo. Esta analisa inter- relações entre um grande número de variáveis e visa diminuí-las, explicar essas variáveis em termos de suas dimensões inerentes (Componentes)89. A PCA busca uma forma de 51 comprimir a informação contida em um número elevado de variáveis originais a um conjunto menor de variáveis componentes desde que haja uma perda mínima de informação, caso contrário não seria um valor representativo. O número de componentes principais se torna o número de variáveis consideradas na análise, contudo, é comum, que as primeiras componentes representam a maior parte dos dados. As componentes principais em geral são extraídas via matriz de covariância, mas também podem ser extraídas via matriz de correlação90. A PCA se desenvolve transformando os dados numa matriz, assumindo-a como X, essa é desdobrada tridimensionalmente representada por X(i,j,k), sua matriz transposta (XT), com média empírica nula, onde cada uma das n linhas representa uma repetição diferente do experimento, e cada uma das m colunas dá um tipo particular de dado. É dito que a matriz XT é definida aqui e não X propriamente dito, e o que alguns autores chamam de XT é por vezes denotado apenas por X. A PCA calcula decompondo a matriz em valores singulares de X, X = WΣVT, onde a matriz Wm × m corresponde à matriz de autovetores da matriz de covariância XXT, a matriz Σm × n representa a diagonal retangular com números reais não negativos na diagonal, e a matriz Vn × n é a de autovetores de XTX. Dessa forma, a transformação PCA é capaz de preservar a dimensionalidade dos dados originais, que dá o mesmo número de componentes principais do que o número de variáveis originais. De forma geral a PCA pode ser definida pela equação 4: X = t1p1 t + t2p2 t + ... + thph t + E = thph t + E Eq. 4 52 Figura 15: Classificação de amostras por Análise de Componentes Principais Fonte: REIS, 2022 Outra técnica aplicada neste trabalho foi a Regressão parcial de mínimos quadrados, do inglês Partial Least Squares (PLS), uma técnica que reduz os preditores a um conjunto menor de componentes que podem ser correlacionados e efetua regressão de mínimos quadrados para esses componentes no lugar dos dados originais. A regressão por PLS é particularmente útil quando os preditores são altamente colineares ou quando existem mais preditores do que observações e a regressão de mínimos quadrados ordinários geram coeficientes com erros padrão altos ou que falha totalmente. A PLS não assume que os preditores são fixos, ao contrário da regressão múltipla. Isto significa que os preditores podem ser medidos com erro, tornando a PLS mais robusta à incerteza da medição90. Sendo assim, a regressão por mínimos quadrados parciais busca um conjunto de vetores (variáveis latentes) para os dados obtidos da análise e um conjunto separado de vetores base para os dados de concentração das soluções em estudo e, em seguida, a PLS os relaciona um com o outro. A relação básica entre esses dois conjuntos de vetores é 53 apresentada na equação 5, diferentemente do exposto pela equação 4 da PCA, mas ainda com a mesma base, Yf = Bf · Xf Eq. 5 onde, Yf é a projeção dos dados de concentração sobre o f-ésimo fator de concentração. Xf é a projeção dos dados espectrais correspondentes sobre o fésimo fator analítico. Bf é a constante de proporcionalidade para o f-ésimo par de fatores concentração e resposta analítica. A ideia geral do PLS é tentar alcançar, tanto quanto possível, a congruência ótima entre cada fator espectral e seu fator concentração correspondente, ou seja, encontrar uma relação perfeitamente linear entre as projeções (scores) dos dados espectrais e de concentração sobre os seus respectivos fatores88. Haja visto o número elevado de dados gerados em uma imagem a sua análise univariada torna-se inviável, é visto que recursos como a PCA e a PLS são de enorme ajuda para solver problemas como os apresentados neste trabalho. A utilização de imagens digitais a partir do sistema RGB vem sendo uma ferramenta de suporte eficiente e ganha mais destaque a cada dia em inúmeras áreas como na agricultura, medicina, química, biologia, engenharias e claro nas ciências forenses também. Uma pesquisa simples nas principais plataformas de pesquisa revela números consideráveis. Por exemplo, ao se buscar pela associação microfluidic combinada a colorimetric obtém-se um total de 1357 publicações na base de pesquisa da Web of Science, já a base Scopus fornece um total de 1143 publicações para a mesma referida busca. Ao se refinar a busca acrescentando a palavra drugs o retorno é de 64 publicações para a Web of Science, valor superado pelo Scopus ao retornar 103 publicações. Sendo que, mesmo o refino ao acrescentar a palavra paper na Web of Science resulta ainda em 36 artigos dos quais 28 contemplam apenas os 5 últimos anos, demonstrando o quanto o caminho é promissor e está sendo investigado, como pode ser observado na Figura 16. Fato este confirmado pela base Scopus ao revelar 39 artigos para este último mesmo refino dos quais 39 foram divulgados de 2018 a diante. Visto assim, o referencial teórico corrobora que o emprego de imagens digitais para medidas qualitativas e quantitativas nos µPADs com base na interpretação do sistema RGB por aplicativos quimiométricos vem crescendo e ocupando o seu espaço. Uma vez que essa pode se aliar a técnicas baratas e eficientes como microfluídica em papel devido a evolução da tecnologia que permite extrair ainda mais informações das práticas colorimétricas tradicionais. 54 Figura 16: Resultado da Web of Science por ano de publicação para o refino “Colorimetric and Microfluidic and Drugs and Paper” Fonte: Web of Science, 2022 O assunto presente nesta tese traz um assunto de suma importância para as ciências forense haja visto o crescente número de publicações que subiram de 15 em 2016 para 37 em 2019, mais que dobrando em 4 anos. É visto que a colorimetria aplicada à técnica de dispositivos microfluídicos a base de papel permite uma análise rápida e não destrutiva da amostra já que há quantidade baixa de amostra necessária. O recurso tecnológico dos tratamentos matemáticos por meio de smartphones do cotidiano permitiu maior confiabilidade ao recurso colorimétrico como processo in loco, daí o aumento de buscas, citações e publicações sobre o assunto como demonstrado na Figura 17. 55 Figura 17: Resultado da Web of Science por área para o refino “Colorimetric and Microfluidic and Drugs and Paper” Fonte: Web of Science, 2022 Vale destacar ainda que o Brasil detém o maior número de correspondentes na área, 27 contra os 20 dos Estados Unidos, contudo o país só aparece em quarto lugar no número de citações ficando atrás de França, México e Estados Unidos, tendo menos de um terço das citações da França. O uso de colorimetria na investigação criminal é aparece entre os últimos lugares no âmbito de publicações voltadas para a colorimetria com recursos microfluídicos, o destaque vai para o agronegócio e tudo isso reflete na “nuvem de palavras” relacionadas ao assunto construído com o auxílio do bibliometrix como exposto na Figura 18. 56 Figura 18: Nuvem de palavra resultante da construção com as palavras “Colorimetric and Microfluidic and Drugs and Paper” no bibliometrix Fonte: Bibliometrix do Wef of Science e Scopus, 2023 Essa exposição pode ser matematicamente demonstrada pela “árvore de valores” construída com os dados numéricos e mostrados na Figura 19. Figura 19: Árvore de palavras resultante da construção com as palavras “Colorimetric and Microfluidic and Drugs and Paper” no bibliometrix Fonte: Bibliometrix do Wef of Science e Scopus, 2023 57 Dessa forma o uso de recursos colorimétricos na investigação de drogas, sejam essas lícitas ou ilícitas, se tornou um caminho confiável, rápido e barato. Tendo um vasto campo investigativo, com inúmeras oportunidades que ainda não foram pensadas, permitindo ainda diversos caminhos, mesmo com a técnica já consolidada ainda há possibilidades de complementação como o uso de ferramentas quimiométricas e imagens digitais para dar fim a subjetividade do olho humano. 58 2. OBJETIVOS 2.1 Geral Este trabalho tem como objetivo geral confeccionar µPADs para aplicar em amostras apreendidas de cocaína, crack e maconha a fim de identificar e quantificar as substâncias que tornam essas drogas ilícitas. 2.1 Específicos  Construir o planejamento experimental para encontrar os pontos ótimos para os fatores influentes;  Desenhar e confeccionar µPADs no papel;  Avaliar o melhor formato dos µPADs para análises;  Usar planejamento experimental para avaliar valores de quantidade de reagentes, tamanho do raio dos poros e tempo de reação;  Testar os µPADs confeccionados em ponto ótimo quanto ao limite de detecção para cloridrato de cocaína em amostras apreendidas de cocaína e de crack;  Testar os µPADs confeccionados em ponto ótimo quanto ao limite de detecção para THC em amostras apreendidas de maconha;  Usar ferramentas quimiométricas para agrupar amostras e quantificá-las; 59 3. METODOLOGIA 3.1 Amostras de Cocaína e Crack 3.1.1 Otimização e construção dos µPADs Os µPADs foram construídos com o auxílio de uma impressora de cera ColorQube 8880 em uma folha de papel A4. As soluções padrão foram preparadas a partir de 100 mg de cocaína (padrão produzido pela Polícia Federal do Rio Grande do Sul). As fotos foram geradas com um Smartphone Samsung J8 com aplicativo Photometrix®. No total, foram analisadas 60 amostras de rua, sendo 30 de cocaína e 30 de crack. Figura 20. Apresentação de Otimização de μPADs Fonte: autor Os µPADs foram projetados com o auxílio do programa power point do Windows. Foram projetados μPADs de três diâmetros diferentes – 6, 8 e 10 mm, pois este foi um dos fatores estudados com o planejamento experimental. A impressora ColorQube 8880 foi usada para imprimir μPADs em folhas A4 chamex padrão. Após a impressão, a folha com a cera foi totalmente impregnada com cera, colocando os μPADs em estufa a 120 °C por 5 minutos. As soluções padrão para a curva analítica do cloridrato de cocaína foram preparadas. Exatamente 100 mg de amostra foram pesados e dissolvidos em 10 mL de água ultrapura. Usando a solução estoque de 10 mg mL-1 preparada, partes da solução foram diluídas para preparar oito padrões adicionais de diferentes concentrações - 9, 8, 6, 5, 4, 3, 2 e 1 mg mL- 1 - que foram usados para construa a curva analítica. Vale ressaltar que a construção da curva analítica é importante por se tratar de outro fator estudado no planejamento - a influência da concentração do cloridrato de cocaína na eficiência da sensibilidade dos μPADs. O terceiro fator estudado foi a porcentagem de tiocianato de cobalto II, [Co(SCN)2] adicionado que poderia reagir com a droga. O teste original utiliza a solução fornecida pelo acordo de cooperação, processo 23068.011398/2012-72, com a PC-ES. O estudo também 60 avaliou se a concentração de tiocianato aumenta a seletividade da técnica para cocaína. Neste trabalho, testamos valores de 50, 75 e 100% em relação à solução padrão fornecida pelo PC-ES89. Com os μPADs preparados e as soluções de cloridrato de cocaína e [Co(SCN)2], o próximo passo foi a construção do delineamento experimental. Optou-se por um planejamento fatorial, pois não havia entendimento de como cada fator influenciaria o modelo. Um total de seis experimentos foram realizados. No primeiro, os fatores escolhidos para o planejamento foram a concentração de cloridrato de cocaína, a concentração de [Co(SCN)2] e o diâmetro do μPAD, mantendo fixo o tempo de detecção. No primeiro experimento, o tempo de detecção foi definido como t = 0 s, e as imagens do teste colorimétrico foram adquiridas imediatamente após o experimento. Para os outros cinco tempos, o fator tempo de espera foi tratado de forma unidimensional com valores de 30 min, 1 hora, 12 horas e 24 horas - espera pela aquisição das imagens e análise no aplicativo Photometrix®. Foi montado um planejamento fatorial com três fatores, totalizando oito experimentos, com três experimentos somados ao ponto central, totalizando 11 experimentos (ver Tabela 2). No qual Fator 1 (% de tiocianato), Fator 2 (Diâmetro (mm) e Fator 3 (Cloridrato de Cocaína (mg∙mL-1). Enquanto a Resposta* é a precisão do modelo na predição da concentração de cocaína obtida pela previsão se a curva de aplicação corresponde à concentração real da amostra. Tabela 2. Planejamento fatorial experimental com 3 fatores. Experimento Fator 1 Fator 2 Fator 3 Resposta* 1 100 10 8 2 50 10 8 3 100 6 8 4 50 6 8 5 100 10 4 6 50 10 4 7 100 6 4 8 50 6 4 9 75 8 6 10 75 8 6 11 75 8 6 Cada experimento utilizou 3 µL de solução de cloridrato de cocaína e 3 µL de solução de Tiocianato de Cobalto II fornecida pela PC-ES. Por exemplo, no experimento 1, foram pipetados 3 µL de 100% da solução de [Co(SCN)2], seguido de espera de 5 minutos para a impregnação total e uniforme do µPAD. A seguir, foram aplicados 3 µL de solução de cloridrato na concentração de 8 mg mL-1. Os outros experimentos foram realizados usando 61 os mesmos procedimentos. Em seguida, foram construídos seis experimentos, sendo um contendo quatro fatores, sendo o último fator o tempo de espera pela resposta, que é utilizado para determinar a concentração de cocaína por meio do aplicativo Photometrix®. Nos outros cinco horários, o fator tempo de espera foi tratado de forma unidimensional com seus valores de espera - t = 0 s, 30 min, 1 hora, 12 horas e 24 horas - para análise com o Photometrix®. Um modelo PLS foi construído usando três níveis diferentes de concentrações e nove níveis na curva analítica. Como as concentrações das soluções eram conhecidas, a eficiência/precisão - comparação entre os valores medidos e reais - foi utilizada como resposta para cada experimento realizado, obtendo-se assim cinco planos. 3.1.2 Amostras analisadas Com o planejamento concluído e a curva analítica construída, analisamos as amostras apreendidas pela PC-ES, que incluíam amostras de cocaína (n = 30) e crack (n = 30). Cada amostra foi processada usando o mesmo procedimento, no qual uma massa de 30 mg foi dissolvida em 2 mL de água ultrapura. Após a construção dos μPADs com 8 mm de diâmetro, foram pipetados 3 µL de solução 100% [Co(SCN)2], onde foi realizada uma impregnação total e uniforme do ΜPAD por cinco minutos, e em seguida 3 µL de solução foi aplicado para cada amostra desconhecida. Após 1 hora, o software Photometrix® foi usado para construir o modelo PLS e prever o teor de cloridrato de cocaína em cada amostra. Por fim, foi realizada uma análise de PCA para determinar a similaridade entre as amostras apreendidas de cocaína e crack. 3.1.3 Aplicação do Photometrix® Para análise dos dados, foi utilizado o software Photometrix® desenvolvido pelo grupo de pesquisa em quimiometria da Universidade de Santa Cruz do Sul (RS, Brasil). Este software está disponível gratuitamente na loja de aplicativos Android® e IOS® (http://www.photometrix .com.br). O software contém ferramentas de análise multivariada e permite ao usuário realizar análise de componentes principais, do inglês Principal Component Analysis (PCA), regressão de mínimos quadrados parciais, do inglês Partial Least Squares (PLS) e análise de agrupamento hierárquico, do inglês Hierarchical Cluster Analysis (HCA). 62 A interface do aplicativo inclui análises univariadas e multivariadas. Na interface de configuração, o usuário pode determinar a região de interesse, configurações da câmera e cadastrar um e-mail para exportar os dados. O método de análise PCA realizado pelo aplicativo foi rápido e fácil de realizar, com poucos passos até os dados finais e sem a necessidade de processamento de imagem para interpretação dos resultados. Para a construção dos gráficos foram estabelecidos os canais R, G, B, H, S, V, L e I com dados centrados na média. Para realizar este teste, foi utilizado o smartphone Samsung modelo J8 (câmera de 16 megapixels, abertura F 1.7, estabilização digital, resolução de 4032x3024 pixels e sistema operacional Android 8.1). As amostras foram depositadas nos µPADs seguidas dos reagentes. Após o tempo pré-estabelecido, foi realizada uma foto com os μPADs pregados em um fundo branco. Em seguida, os dados foram processados. 3.2 Amostras de Maconha 3.2.1 Construção dos µPADs Um estudo foi desenvolvido de forma semelhante ao aplicado para as amostras de cocaína e de crack tendo resultado próximo, a fim de manter uniformidade os mesmos µPADs foram utilizados para ambas as amostras. Os μPADs foram desenhados no software Office® e impressos em papéis A4 com a impressora de cera ColorQube 8880 e a cera fornecida pelo fabricante da impressora. Os canabinóides foram extraídos das amostras por exposição ao metanol. A resposta colorimétrica confirmando a presença de canabinóides ocorre quando a solução 0,25% m/v de sal Fast blue b apresenta coloração marsala, resultante da mistura de três cores principais, roxo (resposta positiva para CBN), laranja (resposta positiva para CBD) e vermelho (resposta positiva para Δ9-THC). A construção dos µPADs seguiu o desenvolvimento de círculos de 8 mm de diâmetro, e a impressão foi feita em impressora de cera conforme já relatado no parágrafo anterior. Para impregnação total da cera ao papel, os µPADs foram aquecidos em estufa a 120 °C por 5 minutos, o que permite que a cera derreta e impregne o papel como um todo, deixando apenas a área circular ainda hidrofílica. 3.2.2 Amostras analisadas Um Smartphone Samsung® J8 com software Photometrix® foi utilizado para análise colorimétrica por μPADs, a técnica PLS para b