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Título: Avaliação da virulência de isolados dos genótipos T3, T4 e T5 de Acanthamoeba provenientes de amostras clínicas e ambientais
Autor(es): Fernandes, Débora da Vitória de Melo
Orientador: Falqueto, Aloísio
Coorientador: Bueloni, Cinthia Furst Leroy Gomes
Data do documento: 23-Mar-2018
Editor: Universidade Federal do Espírito Santo
Resumo: O gênero Acanthamoeba compreende protozoários que estão amplamente distribuídos nos mais diversos ambientes e por todos os continentes e que são capazes de causar infecções em seres humanos, como a ceratite e a encefalite granulomatosa. A patogênese da Acanthamoeba constitui-se de um processo multifatorial, com fatores que envolvem tanto a ameba quanto o hospedeiro, porém, esse mecanismo de patogenicidade ainda não está totalmente elucidado. O Objetivo desse trabalho foi identificar a virulência de seis isolados de origens clínica e ambiental de Acanthamoeba, com três genótipos diferentes, T3, T4 e T5 – representando os 20 tipos atualmente descobertos, e com duas doses de amebas sobre três tipos diferentes de linhagens celulares de mamíferos, MDCK, VERO e CHO, para testes de efeito citotóxico e de efeito citopático. Amostras clínicas provenientes de cultura de raspados de córnea de pacientes com diagnóstico de ceratite amebiana e as amostras ambientais procedentes de saída de torneira, de água de inundação e de poeira, foram coletadas e axenizadas entre os anos de 2014 a 2017. Considerando que o cultivo prolongado de isolados de Acanthamoeba pode provocar a diminuição ou possível perda da virulência, foi realizada a passagem das amebas em linhagem celular do tipo MDCK para reativar a virulência dos isolados em cultivo prolongado. O efeito citotóxico demonstrou que existe diferença de resultados a depender da linhagem celular utilizada, mas não dos isolados. A passagem em linhagem celular MDCK foi capaz de provocar o aumento da virulência dos isolados Mnus4 (T3-ambiental), Krt15.DFNL (T3-clínico), Krt12.ROS (T4-clínico) e Krt16.PEN (T5-clínico) nos testes de citotoxicidade. Nossos resultados demonstraram que a linhagem celular mais susceptível ao meio condicionado (efeito citotóxico) foi a MDCK, seguida de VERO e CHO. Entretanto, para o ensaio de citopatogenicidade, CHO foi a mais susceptível a exposição aos trofozoítos de Acanthamoeba, seguida de VERO e MDCK. No efeito citopático, os resultados variaram de acordo com o isolado utilizado, com a dose utilizada de trofozoítos e com a passagem em linhagem celular. O aumento do número de trofozoítos de ameba em incubação com as linhagens celulares foi capaz de provocar um aumento na virulência dos isolados dos três genótipos no teste de efeito citopático, sobre, principalmente, as linhagens VERO e CHO. No teste de efeito citopático, o genótipo mais virulento foi o T5, seguido de T4 e T3, sendo o isolado mais virulento o A3P4 (T5) de origem ambiental. Dessa forma, conclui-se que os resultados obtidos com os testes de efeito citopático e citotóxico com as diferentes linhagens de células de mamífero têm variações relacionadas ao tipo de linhagem celular de mamífero utilizada, bem como com as características inerentes de cada isolado. Assim, os resultados aqui obtidos poderão ser auxiliares para o planejamento de futuras pesquisas relacionadas aos estudos da patogenicidade da Acanthamoeba.
The genus Acanthamoeba comprises protozoa that are widely distributed in diverse environments and across all continents and that are capable of causing infections in humans, such as keratitis and granulomatous encephalitis. The pathogenesis of Acanthamoeba constitutes a multifactorial process, with factors that involve both ameba and host, but this mechanism of pathogenicity is not yet fully elucidated. There is little standardization in the methodologies applied here, with variable protocols in the literature. The objective of this work was to identify the virulence variations of six isolates of Acanthamoeba, from clinical and environmental backgrounds, with three different genotypes, T3, T4 and T5 - representing the 20 types of findings, and with two doses of amoebae on three types different from mammalian cell lines, MDCK, VERO and CHO, using cytotoxic effect and cytotoxic effect methodologies. Clinical samples are obtained from cultured corneal scrapings of patients diagnosed with amoebic keratitis, and as environmental samples are obtained from faucet outlet, flood water and dust, collected and axenized between the years 2014 and 2017. Considering that prolonged cultivation of Acanthamoeba isolates may cause a decrease or loss of virulence of the amoeba, we use the passage of the amebae in MDCK cell line to reactivate the virulence of the isolates in prolonged culture. Our data demonstrated that a cell line more susceptible to conditioned medium (cytotoxic effect) was MDCK, followed by VERO and CHO. However, for the cytopathogenicity assay, CHO was one more susceptible to exposure to Acanthamoeba trophozoites, followed VERO and MDCK. In the cytopathic effect, the results varied according to the isolate used, the dose used of trophozoites and the passage in cell line. The increase in the number of amoeba trophozoites in incubation with the cell lines was able to provoke an increase in the virulence of the isolates of the three genotypes in the cytopathic effect test, especially the VERO and CHO lines. In the cytopathic effect test, the most virulent genotype was T5, followed by T4 and T3, the most virulent isolate was A3P4 (T5) of environmental origin. Thus, it is concluded that the results obtained with the cytopathic and cytotoxic effect tests with the different mammalian cell lines have variations related to the type of mammalian cell line used, as well as the inherent characteristics of each isolate. Therefore, the results obtained here may be useful for the planning of future research related to the pathogenicity studies of Acanthamoeba.
URI: http://repositorio.ufes.br/handle/10/10378
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