Caracterização por citometria de fluxo das células de sangue, medula óssea e aorta de camundongos hipertensos

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dc.contributor.advisor-co1Vasquez, Elisardo Corral
dc.contributor.advisor1Meyrelles, Silvana dos Santos
dc.contributor.authorCampagnaro, Bianca Prandi
dc.contributor.referee1dos Santos, Leonardo
dc.contributor.referee2Pereira, Thiago de Melo Costa
dc.contributor.referee3da Silva, Valdo José Dias
dc.date.accessioned2018-08-01T22:59:18Z
dc.date.available2018-08-01
dc.date.available2018-08-01T22:59:18Z
dc.date.issued2012-12-07
dc.description.abstractAngiotensin II has been recognized for a long time as a powerful vasoconstrictor. In addition, several studies have attributed a variety of other biological activities to this peptide, such as, cellular growth, proinflammatory and immunomodulator effects. However, some reports show that high angiotensin II levels increase reactive oxygen species (ROS) production and, consequently, apoptosis in target organs of the disease, the analysis of this peptide effect by flow cytometry remains unclear in the 2K1C model. The objective of this study was to evaluate the effects of 2K1C renovascular hypertension on blood, endothelium and bone marrow cells in mice. Experiments were conducted on male C57 mice (averaging 23 g), which were randomly separated in two groups: Sham (n=25) and two-kidney one-clip (2K1C, n=25). The renovascular 2K1C hypertension was induced by placing a stainless clip around the left renal artery. The Sham group was subjected to the same surgical procedure, without clip placement. Animals were studied 14 days later, when a catheter was inserted into the right carotid artery for direct arterial pressure measurements. Then, the animals were euthanized, and blood collected by heart puncture. After perfusion, endothelial cells were mechanically isolated from thoracic aorta and placed in warmed HBSS. Bone marrow cells were flushed out of tibias and femurs and placed in ice-cold PBS. Cells were counted using a Neubauer chamber. The identification of endothelial cells was determined by immunofluorescence detection after incubation with CD31-APC (5μl/106 cells). Oxidative stress was determined by H2O2 and O2•- production using the probes DHE and DCFH-DA, respectively. 106 cells were diluted with 1mL PBS and incubated with 20mM DCFHDA and 160µM DHE for 30 min at 37ºC in the dark, then washed and resuspended in 0.5ml of PBS. In order to analyze apoptosis, 106 cells were resuspended in Binding Buffer (BB) and incubated with 5µl of Annexin V-FITC and 5µl of propidium iodide (PI) at room temperature for 15 min in the dark and resuspended in 0.5ml of BB. To assay DNA content, 106 cells were fixed in ice-cold 70% ethanol and fixed at -20ºC. Cells were washed with ice-cold PBS and resuspended in 200μl of staining solution (20mg/ml RNAse, 500μg/ml PI, 10% Triton X-100). All cell preparations were stored on ice, and flow cytometric measurements were terminated within 4 hr. A FACSCanto II cytometer was used for the flow cytometric analysis. FSC and SSC were used to establish size gates and exclude cellular debris from the analysis. In each measurement, 30000 events were analyzed. Data were acquired and analyzed using the BD FACSDiva and FCS Express softwares. Data are means±SEM. Statistical analysis was performed with Student’s t test and Wilcoxon’s. As expected, blood pressure was higher in 2K1C than in Sham mice (Sham: 103±0.8 vs. 2K1C: 144±5.6 mmHg). Flow cytometric analysis showed that 2K1C mice presented a significant increase in O2• - production was higher in blood (Sham: 941±63 vs. 2K1C: 2155±289 a.u.), endothelial (Sham: 432±51 vs. 2K1C: 2630±184 a.u.) and bone marrow (Sham: 1309±175 vs. 2K1C: 12036±2205 a.u.) cells of 2K1C mice compared to Sham. Simultaneously, H2O2 production was also augmented in blood (Sham: 252±23 vs. 2K1C: 531±48 a.u.), endothelial (Sham: 300±30 vs. 2K1C: 1049±112 a.u.) and bone marrow (Sham: 2107±222 vs. 2K1C: 7517±1067 a.u.) cells of 2K1C mice compared to Sham. Apoptosis analysis by Annexin V-FITC/PI demonstrated that hypertensive mice presented higher percentages of apoptotic cells in blood (Q2Sham: 1.5±0.1 vs. Q22K1C: 15.3±3.8; Q4Sham: 1.6±0.2 vs. Q42K1C: 18.3±4.3 %), endothelial (Q2Sham: 1.2±0.2 vs. Q22K1C: 21.1±3.0; Q4Sham: 12.5±2.6 vs. Q42K1C: 31.2±2.4 %) and bone marrow (Q2Sham: 5.7±0.6 vs. Q22K1C: 22.5±2.5; Q4Sham: 12.9±1.1 vs. Q42K1C: 27.2±2.5 %) cells compared to Sham. DNA content analysis showed augmented DNA fragmentation in bone marrow cells of 2K1C (1.54±0.26 %) mice compared to Sham (0.50±0.09 %). Our data suggest that renovascular hypertension increases reactive oxygen species production leading to oxidative stress and, consequently, apoptosis in blood, endothelial and bone marrow cells of hypertensive mice. In addition, this model of experimental hypertension leads to DNA damage which could be due to augmented reactive oxygen species which is known to cause DNA fragmentation.eng
dc.description.resumoA angiotensina II foi considerada durante muito tempo apenas como um hormônio vasoativo. Entretanto, sabe-se que além de um potente vasoconstritor, a angiotensina II apresenta funções biológicas importantes na regulação do crescimento e proliferação celular, além de atuar como imunomodulador indutor de respostas inflamatórias. Apesar de muitos estudos demonstrarem que a angiotensina II aumenta a produção de ROS, levando a ativação de mecanismos de apoptose em órgãos-alvo da hipertensão, pouco se sabe a respeito dos efeitos da hipertensão renovascular 2R1C sobre células hematopoiéticas e endoteliais. Por isso, este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos da hipertensão renovascular 2R1C sobre células sanguíneas, endoteliais e de medula óssea, por citometria de fluxo, em camundongos. Para isso, camundongos C57 machos (~23g) foram separados em dois grupos Sham (n=25) e 2R1C (n=25). A hipertensão foi induzida no grupo 2R1C pela colocação de um clipe de aço ao redor da artéria renal esquerda. O grupo Sham foi submetido ao mesmo procedimento cirúrgico, porém sem a colocação do clipe. Após 14 dias, os animais tiveram sua artéria carótida cateterizadas para medidas hemodinâmicas. Em seguida, os animais foram eutanasiados, e o sangue coletado por punção cardíaca. Após a perfusão, as células endoteliais foram mecanicamente isoladas da aorta torácica e mantidas em solução de HBSS. As células da medula óssea foram isoladas dos fêmures e tíbias e colocadas em DMEM. As células foram quantificadas em câmara de Neubauer. A identificação de células endoteliais foi realizada por imunofenotipagem utilizando o anticorpo CD31-APC (5μl/106 células). Para análise do estresse oxidativo 106 células foram diluídas em PBS e incubadas com 160μM de DHE e 20mM de DCFH-DA por 30 minutos a 37ºC no escuro e, depois lavadas e ressuspendidas em 0,5ml de PBSiFBS. Para a análise de apoptose 106 células foram ressuspendidas em tampão de ligação e incubadas com 5μl de anexina V-FITC e 5μl de iodeto de propídeo (PI) a temperatura ambiente, por 15 minutos, no escuro e foram ressuspendidas em 0,5ml de tampão de ligação. Para avaliar o conteúdo de DNA, 106 células foram fixadas em etanol 70% gelado, lavadas com PBS e ressuspendidas em 200μl de solução de coloração (20mg/ml RNAse, 500μg/ml PI, 10% Triton X-100). As amostras foram mantidas em gelo até o momento da aquisição dos dados pelo citômetro de fluxo FACSCanto II. Em cada experimento foram avaliadas 30000 células. Os dados foram analisados com o auxílio dos softwares BDFACSDiva e FCS Express 4.0. Os dados estão expressos como média±EPM e a análise estatística foi realizada por teste t de Student ou Wilcoxon. Como esperado os animais 2R1C apresentaram níveis maiores de pressão arterial (144±5,6 mmHg) quando comparados com os respectivos controles (103±0,8 mmHg). A análise por citometria de fluxo mostrou aumento na produção de O2• - nas células sanguíneas (Sham: 941±63 vs. 2R1C: 2155±289 a.u.), endoteliais (Sham: 432±51 vs. 2R1C: 2630±184 a.u.) e da medula óssea (Sham: 1309±175 vs. 2R1C: 12036±2205 a.u.) de animais 2R1C quando compara aos animais Sham. Simultaneamente, também observamos aumento na produção de H2O2 nas células sanguíneas (Sham: 252±23 vs. 2R1C: 531±48 a.u.), endoteliais (Sham: 300±30 vs. 2R1C: 1049±112 a.u.) e da medula óssea (Sham: 2107±222 vs. 2R1C: 7517±1067 a.u.) dos animais hipertensos comparado aos animais normotensos. A análise de apoptose pela marcação com AnexinaV-FITC/PI, mostrou que os animais hipertensos apresentam mais apoptose em células sanguíneas (Q2Sham: 1,5±0,1 vs. Q22R1C: 15,3±3,8; Q4Sham: 1,6±0,2 vs. Q42R1C: 18,3±4,3 %), endoteliais (Q2Sham: 1,2±0,2 vs. Q22R1C: 21,1±3,0; Q4Sham: 12,5±2,6 vs. Q42R1C: 31,2±2,4 %) e de medula óssea (Q2Sham: 5,7±0,6 vs. Q22R1C: 22,5±2,5; Q4Sham: 12,9±1,1 vs. Q42R1C: 27,2±2,5 %) nos animais do grupo 2R1C quando comparado aos Sham. Além disso, as células da medula óssea dos animais 2R1C (1,54±0,26 %) apresentaram aumento na fragmentação do DNA quando comparado com os animais Sham (0,50±0,09 %). Nossos resultados sugerem que a hipertensão renovascular 2R1C aumenta a produção de espécies reativas de oxigênio levando ao estresse oxidativo e, conseqüentemente a apoptose em células sanguíneas, endoteliais e de medula óssea isoladas de camundongos hipertensos. Além disso, neste modelo de hipertensão experimental as espécies reativas de oxigênio aumentadas interagem com o DNA das células, fragmentando-o.
dc.formatText
dc.identifier.citationCAMPANARO, Bianca Prandi. Caracterização por citometria de fluxo das células de sangue, medula óssea e aorta de camundongos hipertensos. Tese (Doutorado em Ciências Fisiológicas) - Universidade Federal do Espírito Santo, Centro de Ciências da Saúde, Vitória, 2012.
dc.identifier.urihttp://repositorio.ufes.br/handle/10/8051
dc.languagepor
dc.publisherUniversidade Federal do Espírito Santo
dc.publisher.countryBR
dc.publisher.courseDoutorado em Ciências Fisiológicas
dc.publisher.departmentCentro de Ciências da Saúde
dc.publisher.initialsUFES
dc.publisher.programPrograma de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas
dc.rightsopen access
dc.subjectRenovascular hypertensioneng
dc.subjectAngiotensin IIeng
dc.subjectFlow cytometryeng
dc.subjectROSeng
dc.subjectApoptosiseng
dc.subjectDNA fragmentationeng
dc.subjectHipertensão renovascularpor
dc.subjectAngiotensina IIpor
dc.subjectCitometria de fluxopor
dc.subjectApoptosepor
dc.subjectFragmentação do DNApor
dc.subject.cnpqFisiologia
dc.subject.udc612
dc.titleCaracterização por citometria de fluxo das células de sangue, medula óssea e aorta de camundongos hipertensos
dc.title.alternativeFlow cytometric analysis of 2K1C renovascular hypertension on blood, endothelial, and bone marrow cells in mice
dc.typedoctoralThesis
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