Variabilidade genética em NOTCH1: associação com o excesso de peso e implicações terapêuticas na Leucemia Linfocítica Crônica em uma coorte de idosos

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bibo.pageEnd202
dc.contributor.advisor1Zeidler, Sandra Lúcia Ventorin Von
dc.contributor.advisor1IDhttps://orcid.org/0000000288975747
dc.contributor.advisor1Latteshttp://lattes.cnpq.br/5785612863130498
dc.contributor.authorBarcelos, Estevão Carlos Silva
dc.contributor.authorIDhttps://orcid.org/0000-0001-7076-6165
dc.contributor.authorLatteshttp://lattes.cnpq.br/6899125943013073
dc.contributor.referee1Maranduba, Carlos Magno da Costa
dc.contributor.referee1IDhttps://orcid.org/0000-0001-7327-1934
dc.contributor.referee1Latteshttp://lattes.cnpq.br/4763153859701731
dc.contributor.referee2Naslavsky, Michel Satya
dc.contributor.referee2IDhttps://orcid.org/0000-0002-9068-1713
dc.contributor.referee2Latteshttp://lattes.cnpq.br/5084104783599564
dc.contributor.referee3Nogueira, Breno Valentim
dc.contributor.referee3IDhttps://orcid.org/0000-0002-2199-0635
dc.contributor.referee3Latteshttp://lattes.cnpq.br/0011229320439147
dc.contributor.referee4Paula, Flavia de
dc.contributor.referee4IDhttps://orcid.org/0000000186792982
dc.contributor.referee4Latteshttp://lattes.cnpq.br/7913201450663683
dc.date.accessioned2024-05-30T00:52:58Z
dc.date.available2024-05-30T00:52:58Z
dc.date.issued2021-09-03
dc.description.abstractNOTCH1 is critical for the maintenance of stem cells and adult tissues, and appears to play as a key molecule in aging and in a variety of chronic conditions, including obesity and cancer, especially Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL). Recently, the NOTCH1 signaling pathway has been identified as fundamental in adipocyte homeostasis, in addition to being directly linked to the inflammatory process. Furthermore, constitutive activation of NOTCH1 signaling is associated with poor prognosis in some types of cancer such as CLL where recurrent NOTCH1 mutations are responsible for stabilizing the signaling state. Given the involvement of the NOTCH1 gene in cell metabolism and development, the hypothesis of the present study is that genetic variations of NOTCH1 are associated with increased risk for overweight (overweight and obesity) and also alter the response of CLL cells to induced-stress. Therefore, as a first objective, we investigated whether genetic variations in NOTCH1 are associated with overweight/obesity in a Brazilian elderly cohort. To assess the association of NOTCH1 polymorphisms and overweight/obesity, anthropometric, biochemical, medical history, and lifestyle data were collected. Sequencing data from 1.024 individuals (aged 59 to 99 years) were analyzed: 424 were overweight, 320 were obese, and 280 were normal weight. We analyzed one hundred and sixty-one tag SNPs spanning the entire NOTCH1 gene and borders using the SNP tagging approach (minor allele frequency≥0.01 and pairwise linkage disequilibrium r2≥0.8). We observed the association of SNP rs9411207 with risk of overweight/obesity under the additive model, and the genotype distribution showed an increased frequency of homozygous TT (OR = 1.50, 95% CI: 1.20-1.88; P = 0.0002). The GAT haplotype constructed from this and other SNPs in high linkage disequilibrium (LD) was more frequent in overweight/obese subjects (P = 0.003). In silico analysis suggested that these SNPs likely affect the transcription of NOTCH1 and other genes. This is the first study reporting the association between NOTCH1 SNPs and risk of overweight/obesity. Considering the possibility of modulation of NOTCH1, additional population studies are needed to replicate these results and confirm the usefulness of these risk genotypes for new therapeutic strategies. A second objective was to evaluate whether the mutation in the NOTCH1 gene and the deregulation of the NOTCH1 pathway in CLL cases alter the response to curcumin. For this, we investigated the anti-CLL effect of curcumin and its ability to interfere in the integrated stress response (ISR) and in the NOTCH1 signaling pathway in primary CLL cells with mutation in the NOTCH1 gene and in the murine model of CLL Eμ-TCL1. Initially, gene expression data from cells with c.7544- 7545 delCT mutation in NOTCH1 were analyzed against data from Wild-Type (WT) cells. In silico analysis of gene expression of CLL cells mutated in NOTCH1 showed an increase in the expression of genes involved in Endoplasmic Reticulum (ER) and ISR stress. Primary CLL cells were collected and cultured with curcumin, a natural compound that also targets ER stress, for further analysis by Western blotting and real-time PCR. After in vitro exposure to curcumin, stress-related mechanisms were observed in primary cells with mutated NOTCH1 compared to WT cells. This response was preceded by an early increase in Ca2+ in the cytoplasm of CLL cells mutated in NOTCH1, which can trigger and maintain ER stress. Furthermore, curcumin increased the apoptosis of CLL cells carrying the NOTCH1 mutation, regardless of allelic load, when compared to WT cells. NOTCH1 signaling also appears modulated after exposure to curcumin. In particular, CLL cells mutated in NOTCH1 showed a reduction in the active portion of NOTCH1 (ICN1) and in the antiapoptotic proteins of the BCL2 family (BCL2 and MCL1), and the combination of curcumin with venetoclax, an anti-BCL2, shown to have a synergistic effect on CLL cells. In addition, we used the murine model Eμ-TCL1 to evaluate treatment with curcumin. In vivo administration of curcumin in the Eμ-TCL1 model significantly reduced the percentage of CD5+/CD19+ leukemic cells infiltrating the liver, spleen and bone marrow, with concomitant inhibition of NOTCH1 signaling in leukemic cells in the bone marrow. Our results suggest that ER stress-induced ISR activation and NOTCH1 signaling inhibition converge to amplification of CLL cell death and provide a crucial target for CLL treatment.
dc.description.resumoNOTCH1 é fundamental para a manutenção de células-tronco e tecidos adultos, e parece atuar como molécula chave no envelhecimento e em diversas condições crônicas, incluindo a obesidade e o câncer, em especial a Leucemia Linfocítica Crônica (LLC). Recentemente, a via de sinalização de NOTCH1 vêm sendo apontada como fundamental na homeostase de adipócitos, além de estar diretamente ligada ao processo inflamatório. Além disso, a ativação constitutiva da sinalização de NOTCH1 está associada ao mau prognóstico em alguns tipos de câncer, como na LLC onde mutações recorrentes de NOTCH1 são responsáveis pela estabilização do estado de sinalização. Dado o envolvimento do gene NOTCH1 no metabolismo e desenvolvimento celular, a hipótese do presente estudo é que variações genéticas de NOTCH1 estão associadas ao aumento do risco para o excesso de peso (sobrepeso e obesidade) e também alteram a resposta de células de LLC ao estresse provocado por fármacos. Portanto, como primeiro objetivo, investigamos se variações genéticas em NOTCH1 estão associadas ao sobrepeso / obesidade em uma coorte de idosos brasileira. Para avaliar a associação dos polimorfismos de NOTCH1 e o sobrepeso / obesidade, dados antropométricos, bioquímicos, histórico médico e estilo de vida foram coletados. Foram analisados dados de sequenciamento de 1.024 indivíduos (de 59 a 99 anos): 424 apresentavam sobrepeso, 320 obesidade e 280 peso normal. Analisamos cento e sessenta e um tag SNPs abrangendo todo o gene NOTCH1 e bordas através da abordagem de tagging SNP (frequência de alelo menor≥0,01 e desequilíbrio de ligação par a par r 2 ≥0,8). Observamos a associação do SNP rs9411207 com risco de sobrepeso / obesidade sob o modelo aditivo, e a distribuição do genótipo mostrou aumento da frequência de TT homozigoto (OR = 1,50, IC 95%: 1,20-1,88; P = 0,0002). O haplótipo GAT construído a partir deste e de outros SNPs em alto desequilíbrio de ligação (DL) foi mais frequente em indivíduos com sobrepeso / obesidade (P = 0,003). A análise in silico sugeriu que esses SNPs provavelmente afetam a transcrição de NOTCH1 e outros genes. Este é o primeiro estudo relatando a associação entre SNPs de NOTCH1 e risco de sobrepeso / obesidade. Considerando a possibilidade de modulação de NOTCH1, estudos populacionais adicionais são necessários para replicar esses resultados e confirmar a utilidade desses genótipos de risco para novas estratégias terapêuticas. Um segundo objetivo foi avaliar se a mutação no gene NOTCH1 e a desregulação da via NOTCH1 em casos de LLC alteram a resposta à curcumina. Para isso, investigamos o efeito antiLLC da curcumina e sua capacidade de interferir na resposta integrada ao estresse (ISR) e na via de sinalização NOTCH1 em células primárias de LLC com mutação no gene NOTCH1 e no modelo murino de LLC Eμ-TCL1. Inicialmente, foram analisados dados de expressão gênica de células com mutação c.7544-7545 delCT em NOTCH1 em confronto com dados de células Wild-Type (WT). A analise in silico da expressão gênica das células de LLC muatadas em NOTCH1 mostrou um aumento na expressão de genes envolvidos no estresse de Retículo Endoplasmático (RE) e ISR. Células primárias de LLC foram coletadas e cultivadas com curcumina, um composto natural que também tem como alvo o estresse do RE, para posterior análise em Western blotting e PCR em tempo real. Após a exposição in vitro à curcumina, foram observados mecanismos relacionados ao estresse nas células primárias com NOTCH1 mutado em comparação com células WT. Essa resposta foi precedida por aumento precoce de Ca2+ no citoplasma das células de LLC mutadas em NOTCH1, o qual pode desencadear e manter o estresse de RE. Além disso, a curcumina aumentou a apoptose das células de LLC portadoras da mutação em NOTCH1, independentemente da carga alélica, quando comparada com células WT. A sinalização de NOTCH1 também aparece modulada após a exposição à curcumina. Em particular, as células de LLC mutadas em NOTCH1 mostraram redução na porção ativa de NOTCH1 (ICN1) e nas proteínas anti-apoptóticas da família BCL2 (BCL2 e MCL1), sendo que a combinação de curcumina com o venetoclax, um anti-BCL2, mostrou ter um efeito sinérgico em células de LLC. Além disso, utilizamos o modelo murino Eμ-TCL1 para avaliação do tratamento com a curcumina. A administração in vivo de curcumina no modelo Eμ-TCL1 reduziu significativamente a porcentagem de células leucêmicas CD5+ /CD19+ infiltrantes no fígado, baço e na medula óssea, com inibição concomitante da sinalização de NOTCH1 em células leucêmicas na medula óssea. Nossos resultados sugerem que a ativação de ISR induzida pelo estresse de RE e a inibição da sinalização de NOTCH1 convergem para a amplificação da morte de células de LLC e fornecem um alvo crucial para o tratamento de LLC.
dc.description.sponsorshipFundação de Amparo à Pesquisa do Espírito Santo (FAPES)
dc.description.sponsorshipFundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
dc.formatText
dc.identifier.urihttp://repositorio.ufes.br/handle/10/15756
dc.languagepor
dc.publisherUniversidade Federal do Espírito Santo
dc.publisher.countryBR
dc.publisher.courseDoutorado em Biotecnologia
dc.publisher.departmentCentro de Ciências da Saúde
dc.publisher.initialsUFES
dc.publisher.programPrograma de Pós-Graduação em Biotecnologia
dc.rightsopen access
dc.subjectNOTCH1
dc.subjectpolimorfismo de nucleotídeo único e mutações
dc.subjecthaplótipo
dc.subjectsobrepeso / obesidade
dc.subjectleucemia linfocítica crônica
dc.subjectresposta integrada ao estresse
dc.subjectcurcumina
dc.subject.br-rjbnsubject.br-rjbn
dc.subject.cnpqBiotecnologia
dc.titleVariabilidade genética em NOTCH1: associação com o excesso de peso e implicações terapêuticas na Leucemia Linfocítica Crônica em uma coorte de idosos
dc.title.alternativetitle.alternative
dc.typedoctoralThesis
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