Avaliação dos efeitos vasculares do sildenafil na aterosclerose experimental

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dc.contributor.advisor-co1Meyrelles,Silvana dos Santos
dc.contributor.advisor1Vasquez, Elisardo Corral
dc.contributor.authorBalarini, Camille de Moura
dc.contributor.referee1Padilha, Alessandra Simao
dc.contributor.referee2Davel, Ana Paula Couto
dc.contributor.referee3Graceli, Jones Bernardes
dc.contributor.referee4Pereira, Thiago de Melo Costa
dc.date.accessioned2018-08-01T22:59:18Z
dc.date.available2018-08-01
dc.date.available2018-08-01T22:59:18Z
dc.date.issued2013-05-13
dc.description.abstractEndothelial dysfunction is a sine qua non condition to the development of atherosclerosis. Experimentally, this can be demonstrated by an impaired endothelium-dependent vasodilator response to acetylcholine (ACh) that involve nitric oxide (NO). Thus, pharmacological agents that potentiate NO action are considered promising strategies to improve vascular function and reduce atherosclerosis. Among these agents, sildenafil appears to be a good option, once it inhibits phosphodiesterase 5, the enzyme responsible for degrade cGMP, the most important second messenger of NO. So, the aim of this study was to test if sildenafil can ameliorates endothelial dysfunction in experimental atherosclerosis. Male wildtype C57BL/6 (WT) and apolipoprotein E knockout (apoE-/-) mice, which received Western-type diet, were used. ApoE-/- were divided in two groups: treated animals, which received orally sildenafil citrate (40 mg/Kg/day, n=3-10), and vehicle animals, which received vehicle only (n=3-8); WT animals (n=3-10) were used as controls. At the end of treatment, animals were euthanized and had the thoracic aorta removed. Rings were mounted for vascular studies. Vascular function was accessed by concentration-responses curves to cumulative concentrations of ACh (100 pM – 30 µM) or sodium nitroprusside (SNP; 10 pM – 30 µM) , after pre-contraction with phenylephrine (10 µM). To test the influence of NO and reactive oxygen species (ROS) in relaxation responses, rings were pre-incubated with L-NAME (100 µM) or apocynin (300 µM), respectively. In a different set of animals, after the experimental period, mice had their aorta excised and processed to histological evaluation of plaque deposition (dye with Oil Red), ROS production (label with dihydroethidium - DHE) and NO (label with diaminofluorescein - DAF). Responses were expressed as the percentage of dilation relative to the maximal pre-contraction. The maximum effect (Rmax) and the log of the dose of agonist that produced half of Rmax (log EC50) were calculated. Results of pharmacological blockage were expressed as differences in the area under the concentration-responses curves (dAUC) with and without blockage. Values are expressed as means ± SEM. Statistical comparisons were done by ANOVA, followed by Tukey’s post hoc test. Values of *p<0.05 or **p<0.01 vs. WT; # p<0.05 or ##p<0.01 vs. apoE-/- vehicle and § p<0.05 or §§p<0.01 vs. the same group without blockage were regarded as statistically significant. ApoE-/- animals showed markedly vascular dysfunction (Rmax: 66±9.7* e pEC50: 6.1±0.1**) when 10 compared to WT (Rmax: 87±3.6 e pEC50: 7.3±0.1), which was reversed by sildenafil treatment (Rmax: 95±3.1# e pEC50: 7.2±0.3##). This dysfunction was not due to reduction in vascular smooth muscle sensitivity to NO, once no differences were found in SNP responses. The role of NO in relaxation of apoE-/- was diminished (dAUC: 58.3±16.8** vs. WT: 230±10.6) but was restored by sildenafil (233±10.2##). Also, the influence of ROS in reduced vasodilation of apoE-/- was reversed by sildenafil (CT Rmax: 84±5.2 e pEC50: 7.3±0.2; apoE-/- Rmax: 101±4.6§§ e pEC50: 7.3±0.2§§; apoE-/- sildenafil Rmax: 94±3.7 e pEC50: 7.2±0.2). Atherosclerotic plaque evaluation reveled a markedly plaque deposition in aorta of apoE-/- when compared to WT (37.7±3.4** vs. 0.4±0.4%). There was a reduction of 40% in plaque deposition in apoE-/- mice which received sildenafil (37.7±3.4 vs. 21.3±5.0# ). Also, even in control group, a basal level of ROS production was observed (2.25±0.12). In apoE-/- animals there was a increase in oxidative stress (3.47±0.41*), which was restored to the control levels by sildenafil treatment (2.42±0.21# ). Atherosclerotic animals treated with vehicle showed a reduction in NO production when compared to WT (38±5.2 vs. 17.8±1.2*). Chronic sildenafil treatment was able to revert this situation (17.8±1.2 vs. 38.2±6.8# ). Thus, sildenafil treatment restores endothelial function in experimental atherosclerosis. The mechanisms involved in this response do not involve increase in sensitivity of vascular smooth muscle to NO, but ratter restores NO role in endothelium-dependent dilation, probably due to increase in bioavailability of this molecule due to reduced oxidative stress and increased NO production. This amelioration in endothelial function reflects on reduced atherosclerotic plaque deposition in aorta.eng
dc.description.resumoA disfunção endotelial é uma condição sine qua non ao desenvolvimento da aterosclerose. Experimentalmente, pode ser demonstrada pelo comprometimento do relaxamento dependente do endotélio à acetilcolina (ACh), o qual envolve a sinalização da via óxido nítrico/GMP cíclico (NO/cGMP). Deste modo, agentes farmacológicos que sejam capazes de potencializar a ação do NO são considerados estratégias promissoras para melhora da função vascular e redução da aterosclerose. Dentre tais agentes, destaca-se o sildenafil, uma vez que inibe a enzima fosfodiesterase 5 (PDE5), responsável por degradar o cGMP, o principal segundo mensageiro do NO. Desta maneira, o objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos vasculares do sildenafil na aterosclerose experimental. Utilizou-se camundongos machos, das linhagens C57BL/6 (CT) e nocautes para a apolipoproteína E (apoE-/-), os quais receberam dieta aterogênica à partir de 8 semanas de vida, durante as 10 semana subsequentes. Os camundongos apoE-/- foram divididos em 2 grupos: animais tratados, que receberam citrato de sildenafil por via oral durante 3 semanas (40mg/Kg/dia, n=3-10) e veículos, que receberam apenas veículo (n=3-10). Os animais CT foram usados como controles. Ao final do tratamento, os animais foram eutanasiados e tiveram a aorta torácica removida e cortada em anéis para estudos de função vascular. A função vascular foi avaliada por meio da construção de curvas concentração-resposta à ACh (100 pM 30 RM) ou nitroprussiato de sódio (NPS, 10 pM 30 RM), após pré-contração com fenilefrina (Phe, 10 RM). Para avaliar a influência do NO e das espécies reativas de oxigênio (ROS) na resposta vasodilatadora, os anéis foram pré-incubados com L-NAME (100 RM) ou apocinina (300 RM), respectivamente. Em um grupo diferente, após o fim o tratamento os animais tiveram suas aortas retiradas e processadas para avaliação histológica da deposição de placa aterosclerótica (coloração com Oil Red), produção de ROS (marcação com dihidroetídeo - DHE) e de NO (marcação com diaminofluoresceína - DAF). As respostas vasodilatadoras estão expressas como percentual de relaxamento em relação ao valor da pré-contração. A resposta máxima (Rmáx) e o log da dose de droga que provocou metade da resposta máxima (EC50) foram calculados. Resultados de bloqueios farmacológicos foram expressos como a diferença na área abaixo da curva na presença e ausência do inibidor (dAUC). Os resultados estão expressos como média ± EPM. As comparações estatísticas foram feitas por ANOVA, seguida do post hoc de Tuckey. *p<0.05 ou **p<0.01 vs. CT; #p<0.05 ou ##p<0.01 vs. apoE-/- veículo; §p<0,05 ou §§p<0,01 vs. mesmo grupo sem bloqueio. Os animais apoE-/- demonstraram marcante disfunção endotelial (Rmáx: 66±9,7* e pEC50: 6,1±0,1**) quando comparados aos controles (Rmáx: 87±3,6 e pEC50: 7,3±0,1), a qual foi revertida pelo tratamento com sildenafil (Rmáx: 95±3,1# e pEC50: 7,2±0,3##). Tal disfunção não se deve à redução da sensibilidade do músculo liso vascular ao NO, uma vez que não foram observadas diferenças nas respostas ao NPS. O papel do NO na vasodilatação à ACh em animais apoE-/- estava diminuído (dAUC: 58,3±16,8** vs. CT: 230±10,6) e foi restabelecido nos animais tratados (233±10,2##). Ainda, a influência das ROS na vasodilatação reduzida dos animais apoE-/- foi revertida pelo sildenafil (CT Rmáx: 84±5,2 e pEC50: 7,3±0,2; apoE-/- Rmáx: 101±4,6§§ e pEC50: 7,3±0,2§§; apoE-/- sildenafil Rmáx: 94±3,7 e pEC50: 7,2±0,2). A análise da deposição de placa aterosclerótica revelou marcante deposição de placa nos apoE-/- quando comparados aos animais CT (37,7±3,4** vs. 0,4±0,4%) e que houve uma redução de aproximadamente 40% na deposição de placa nos animais apoE-/- tradados com sildenafil (37,7±3,4 vs. 21,3±5,0#). Ainda, observou-se que mesmo os animais controle apresentam um nível basal de produção de espécies reativas de oxigênio (2,25±0,12). Nos animais apoE-/- veículo, houve um aumento do estresse oxidativo (3,47±0,41*), o qual foi revertido aos níveis do controle pelo tratamento com sildenafil (2,42±0,21#). Os camundongos ateroscleróticos que receberam veículo apresentaram redução da produção de NO quando comparados aos controles normocolesterolêmicos (38±5,2 vs. 17,8±1,2*). O tratamento crônico com sildenafil foi capaz de reverter completamente este quadro nos animais ateroscleróticos (17,8±1,2 vs. 38,2±6,8#). Desta maneira, é possível concluir que o tratamento com sildenafil melhora a função endotelial na aterosclerose experimental. Os mecanismos envolvidos nesta resposta não envolvem o incremento da sensibilidade do músculo liso vascular ao NO, mas sim o restabelecimento do NO na vasodilatação dependente do endotélio, provavelmente devido ao incremento da biodisponibilidade desta molécula por conta do estresse oxidativo reduzido e do aumento de sua produção. A melhora na função vascular se reflete na redução da deposição de placa aterosclerótica em aorta.
dc.formatText
dc.identifier.citationBALARINI, Camille de Moura. Avaliação dos efeitos vasculares do sildenafil na aterosclerose experimental. 2013. Tese (Doutorado em Ciências Fisiológicas) - Universidade Federal do Espírito Santo, Centro de Ciências da Saúde, Vitória, 2013.
dc.identifier.urihttp://repositorio.ufes.br/handle/10/8054
dc.languagepor
dc.publisherUniversidade Federal do Espírito Santo
dc.publisher.countryBR
dc.publisher.courseDoutorado em Ciências Fisiológicas
dc.publisher.departmentCentro de Ciências da Saúde
dc.publisher.initialsUFES
dc.publisher.programPrograma de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas
dc.rightsopen access
dc.subjectatherosclerosiseng
dc.subjectendothelial dysfunctioneng
dc.subjectnitric oxideeng
dc.subjectsildenafileng
dc.subjectaterosclerosepor
dc.subjectdisfunção endotelialpor
dc.subjectóxido nítricopor
dc.subject.cnpqFisiologia
dc.subject.udc612
dc.titleAvaliação dos efeitos vasculares do sildenafil na aterosclerose experimental
dc.typedoctoralThesis
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