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Título: Caracterização bioquímica e estrutural da proteína catecol o-metiltransferase (COMT) como potencial alvo para drogas contra paracoccidioidomicose
Autor(es): Cruz, Fabiano Torres
Orientador: Gonçalves, Juliana Barbosa Coitinho
Coorientador: Santos, Alexandre Martins Costa
Data do documento: 28-Mar-2018
Editor: Universidade Federal do Espírito Santo
Resumo: A paracoccidioidomicose (PCM), micose sistêmica causada por fungos do gênero Paracoccidioides, é endêmica na América Latina, sendo o Brasil o país mais afetado. Atualmente, o tratamento com os antifúngicos tradicionais é usualmente longo, de alto custo, restrito a poucas classes de fármacos e com casos de resistência já relatados. A proteína catecol O-metiltransferase (COMT), que não possui estrutura resolvida em Paracoccidioides e nem em outros fungos, catalisa a metilação de um substrato catecol utilizando S-adenosilmetionina e íons Mg2+ como cofatores e parece participar de processos importantes em fungos patogênicos. Assim, sua caracterização bioquímica e estrutural poderia contribuir para o desenvolvimento de novas drogas mais efetivas para o tratamento da PCM. Para estudar a COMT, sua sequência codificadora foi clonada no vetor pET-28aTEV, que adiciona uma cauda de histidinas (His-tag) N-terminal à proteína expressa. O vetor recombinante foi então inserido nas cepas de Escherichia coli BL21, ArcticExpress, Rosetta e Rosetta-gami. A COMT recombinante foi expressa na fração solúvel da ArcticExpress e esta foi submetida à cromatografia de afinidade ao níquel seguida de gel filtração (colunas Ultrahydrogel e Superose 12). O Western blot com anticorpo anti-Histag marcou as duas bandas principais observadas no SDS-PAGE (30 e 60 kDa) da fração obtida após a afinidade. O perfil da gel filtração apresentou três picos principais (frações 1, 2 e 3) que, em SDS-PAGE, mostraram a presença de uma banda proeminente próxima a 60 kDa. As amostras das três frações foram utilizadas em ensaio de atividade para avaliar o consumo de catecol a 35 ºC e pH 7,5 sendo que a fração 2 apresentou maior relação atividade/quantidade de proteína. Cálculos teóricos das massas referentes aos picos da cromatografia de gel filtração indicam que a COMT se comporta como um dímero. A fração 2, apesar de não estar pura, foi submetida a ensaio de desnaturação térmica, onde um processo de agregação ou desnaturação foi detectado em temperaturas acima de 320 K (~47 ºC). O dicroísmo circular da fração 2 indicou um perfil de α-hélice e folhas-β diferente de outras COMT. Um modelo in silico também foi gerado e os dados estruturais obtidos podem contribuir como guia para futuras caracterizações bioquímicas.
Paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis caused by fungi of the genus Paracoccidioides, is endemic in Latin America, with Brazil being the most affected country. Currently, treatment with traditional antifungals is usually long, costly, restricted to a few classes of drugs and with cases of resistance already reported. The catechol O-methyltransferase (COMT) protein, which has no structure solved in Paracoccidioides or other fungi, catalyzes the methylation of a catechol substrate using S-adenosylmethionine and Mg2+ ions as cofactors and appears to participate in important processes in pathogenic fungi. Thus, its biochemical and structural characterization could contribute to the development of new and more effective drugs for the treatment of PCM. To study COMT, its coding sequence was cloned into the pET-28aTEV vector, which adds an N-terminal histidine-tag (His-tag) to the expressed protein. The recombinant vector was then inserted into the strains of Escherichia coli BL21, ArcticExpress, Rosetta and Rosetta-gami. Recombinant COMT was expressed in the soluble fraction of ArcticExpress and it was subjected to nickel affinity chromatography followed by gel filtration (Ultrahydrogel and Superose 12 columns). Western blot with anti-Histag antibody showed the two major bands observed on SDS-PAGE (30 and 60 kDa) of the fraction obtained after affinity. The gel filtration profile showed three main peaks (fractions 1, 2 and 3) which, on SDSPAGE, showed the presence of a prominent band near 60 kDa. Samples from the three fractions were used in an activity assay to evaluate the catechol consumption at 35 ºC and pH 7.5, and fraction 2 showed a higher activity/protein ratio. Theoretical calculations of the masses of gel filtration chromatography peaks indicate that COMT behaves as a dimer. Fraction 2, although not pure, was subjected to thermal denaturation test, where a process of aggregation or denaturation was detected at temperatures above 320 K (~47 ° C). Circular dichroism of fraction 2 indicated an αhelix and β-sheet profile different from other COMT. An in silico model has also been generated and the structural data obtained can contribute as a guide for future biochemical characterization.
URI: http://repositorio.ufes.br/handle/10/7868
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