Determinação da atividade e da estabilidade termodinâmica da isoforma α-tripsina bovina em meios aquo-orgânicos
| dc.contributor.advisor-co1 | Gonçalves, Juliana Barbosa Coitinho | |
| dc.contributor.advisor1 | Santos, Alexandre Martins Costa | |
| dc.contributor.author | Pereira, Evaldo Vitor | |
| dc.contributor.referee1 | Pires, Rita Gomes Wanderley | |
| dc.contributor.referee2 | Fernandes, Patrícia Machado Bueno | |
| dc.contributor.referee3 | Bemquerer, Marcelo Porto | |
| dc.date.accessioned | 2016-06-27T18:23:45Z | |
| dc.date.available | 2016-06-29T06:00:04Z | |
| dc.date.issued | 2015-02-24 | |
| dc.date.submitted | 2015-02-25 | |
| dc.description.abstract | abstract | eng |
| dc.description.resumo | A isoforma α-tripsina bovina foi purificada a partir de amostras comerciais por cromatografia de troca iônica catiônica. A pureza desta amostra foi confirmada por MALDI-ToF cujo valor foi de 23.312 Da. Essa isoforma da tripsina foi submetida a diferentes concentrações de monoalcoóis e DMSO e esta foi capaz de manter a metade de sua atividade em 60% v/v de etanol-tampão. Por essa capacidade outros testes subsequentes foram realizados a fim de entender melhor este processo. O efeito de íons Ca2+ e Cl- estabilizou a α-tripsina em até 20 mmol.L-1, tanto no sistema aquoso quanto no sistema etanol-tampão, contudo acima desta concentração estes íons passaram a desestabilizar a molécula proteica influenciando na diminuição da sua atividade catalítica. Entretanto a estrutura da α-tripsina monitorada por espectroscopia UV nos resíduos aromáticos, com adição de até 80% v/v de etanol permaneceu como na forma nativa. Um teste de cinética comparando a atividade da α-tripsina em tampão e etanol-tampão mostrou que o etanol funcionou como inibidor não competitivo. Entretanto, nos testes de termodinâmica utilizando a técnica de monitoramento do resíduo aromático Tyr a 285 nm, mostrou que na série de monoalcoóis apenas o n-propanol contribuiu de forma significativa na diminuição do Tm em comparação com os demais alcoóis e sistema tampão. Finalmente podemos concluir que o sistema solvente orgânico diminui a atividade enzimática de duas maneiras: atuando como inibidor não competitivo e provocando alterações irreversíveis nas proteínas diminuindo o número de moléculas disponíveis para realizar catálise. | |
| dc.description.resumo | Bovine α-trypsin isoform was purified from commercial samples by cationic ion exchange chromatography. The purity of this sample was confirmed by MALDI-ToF and the value found was 23,312 Da. Trypsin was subjected to different concentrations of mono alcohols and DMSO and it was able to keep half of its activity in 60% v/v ethanol-buffer. Due this capacity, other subsequent tests were performed in order to a better understanding of this process. The effect of Ca2+ and Cl- ions stabilized α-trypsin till 20 mmol.L-1, in both aqueous and ethanol-buffer systems, however above this concentration, these ions tend to destabilize the protein molecule influencing the reduction in its catalytic activity. However, the structure of α-trypsin monitored by UV spectroscopy on the aromatic residues, with addition of 80% v / v ethanol, remained as in native form. A kinetic test comparing the α-trypsin activity in ethanol-buffer and buffer showed that ethanol act as a non-competitive inhibitor. However, in thermodynamic assay using the monitoring technique aromatic residue, Tyr at 285 nm, showed that only n-propanol, in the series of monoalcohols, contributed significantly to decrease the Tm as comparing to with other alcohols and buffer system. Finally, we can conclude that the organic solvent system decreases the enzymatic activity of two ways: by acting as non-competitive inhibitor and causing irreversible changes in the protein by decreasing the number of molecules available to perform catalysis. | |
| dc.format | Text | |
| dc.identifier.uri | http://repositorio.ufes.br/handle/10/1973 | |
| dc.language | por | |
| dc.publisher | Universidade Federal do Espírito Santo | |
| dc.publisher.country | BR | |
| dc.publisher.course | Mestrado em Bioquímica e Farmacologia | |
| dc.publisher.department | Centro de Ciências da Saúde | |
| dc.publisher.initials | UFES | |
| dc.publisher.program | Programa de Pós-Graduação em Bioquímica e Farmacologia | |
| dc.rights | open access | |
| dc.subject | Solventes | por |
| dc.subject | Estabilidade proteíca | por |
| dc.subject | Ativação enzimática | por |
| dc.subject.cnpq | Farmacologia Bioquímica e Molecular | |
| dc.subject.udc | 61 | |
| dc.title | Determinação da atividade e da estabilidade termodinâmica da isoforma α-tripsina bovina em meios aquo-orgânicos | |
| dc.type | masterThesis |